枇杷抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性部位的篩選及其酶動力學

魏愛紅，李曉虹，曾煌,，梁淑荷，林展雯，莊遠杯,，張聲源,*

1(廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室(嘉應學院)，廣東 梅州， 514015) 2(嘉應學院 醫學院客家藥用生物資源研究所，廣東 梅州，514031) 3(嘉應學院 醫學院分子生物學中心實驗室，廣東 梅州，514031)

據國際糖尿病聯盟(International Diabetes Federation，IDF)第10版數據顯示，2021年全球20～79歲的成年糖尿病患者達5.37億，預計到2030年將增至6.43億，到2045年將增至7.83億，中國糖尿病患者居世界首位[1]。持續性高血糖常導致糖尿病心腦血管病變、糖尿病神經病變、糖尿病腎病等并發癥，嚴重危害人體健康[2]。

α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶是降低餐后血糖的重要靶點，作用于該靶點的阿卡波糖等臨床運用制劑在中國糖尿病藥物市場占據主導地位，僅次于胰島素類[3]。但阿卡波糖對α-淀粉酶的過度抑制是其副作用產生的因素之一[4]。中草藥具有多成分、多靶點協調作用的特點，在治療消渴疾病的運用歷史悠久，是現代降血糖先導化合物挖掘的重要來源，從中藥材中挖掘更為安全、低毒、有效的天然α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑在降血糖食品藥品的開發具有重要的意義。

枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.]為薔薇科枇杷屬常綠小喬木，食用藥用歷史悠久，枇杷葉已收錄于《中國藥典》，枇杷花在2019年被批準為新食品原料，而果肉則作為水果食用，表明枇杷資源具有良好的藥用食用基礎，作為大健康食品藥品的開發，具有更高的安全性[5]。

枇杷果肉、莖、花、葉、根、種子均可供藥用，具有降逆和胃、化痰止咳、止瀉功效，主治肺熱咳喘、嘔吐、煩渴等癥狀[6]，現已有枇杷葉膏、枇杷止咳顆粒等多種制劑應用于臨床[7]?，F代藥理研究顯示，枇杷主要含三萜、黃酮、酚類等化學成分，具有鎮咳祛痰、降血糖、抗氧化、降血脂、抗菌消炎等藥理作用[8-12]。枇杷降血糖藥理活性顯著，作為降血糖藥用資源的開發具有廣泛前景。關于枇杷降血糖的研究主要集中于枇杷葉和枇杷花，枇杷不同藥物部位(根、莖、種子、葉、果肉、花)對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性差異的研究未見報道。

本文以枇杷果肉、莖、花、葉、根、種子的95%乙醇提取物為研究對象，測定枇杷不同藥用部位對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制能力，明確活性部位，并進一步探究活性部位醇提取物及其主要組分總黃酮的酶促反應特征，為枇杷資源在降血糖功能食品藥品的開發和高效利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷于2020年7月采自廣東省梅州市梅江區，經嘉應學院醫學院客家藥用生物資源研究所張聲源副教授鑒定為薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Eriobotrya)枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.]。對硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)、對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)，上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、牛血清白蛋白，Sigma有限公司；阿卡波糖，德國拜耳有限公司；可溶性淀粉，天津市大茂化學試劑廠；NaOH，上海麥克林生化科技有限公司；KH2PO4、K2HPO4，阿拉丁有限公司。

1.2 儀器和設備

SPARK酶標儀，TECAN公司；FA2004電子分析天平，德國賽多利斯有限公司；N-1100V旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；MING-CHE 24UV超純水機，法國Merck Millipore公司；PB-21型 pH計，北京賽多利斯科學儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 樣品的制備

枇杷果肉、莖、花、葉、根、種子，曬干，粉碎，按料液比1∶3(g∶mL)加入95%乙醇超聲波提取3次(30 min、35 ℃、100 Hz、200 W)，靜置24 h，用8層紗布過濾，合并提取液，濃縮得到枇杷根醇提物(提取率10.09%)、枇杷莖醇提物(提取率4.64%)、枇杷葉醇提物(提取率7.34%)、枇杷花醇提物(提取率6.21%)、枇杷果肉醇提物(提取率43.90%)、枇杷種子醇提物(提取率7.93%)，保存備用[13]。

枇杷花總黃酮的提取及純化：稱取枇杷花粉末200 g，依照1∶20 (g∶mL)的料液比，加入體積分數為60%的乙醇，超聲波輔助浸提3次(250 W、60 ℃、40 min)，抽濾，合并濾液，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取上清液，濃縮干燥得枇杷花黃酮粗提物32.04 g，提取率16.02%，總黃酮含量以蘆丁當量，即1 g干樣品中黃酮類化合物相當于蘆丁的質量(mg)，以rutin mg/g表示，含量為(44.46±1.34) rutin mg/g。準確配制6 g/L的枇杷花黃酮粗提物溶液，加至AB-8大孔樹脂層析柱，4 h的靜置吸附時間，先用蒸餾水洗去雜質，洗脫到滴出液無色，再用體積分數為50%的乙醇溶液洗脫，洗脫速率為2 BV/h，洗脫體積為3 BV，收集洗脫片段，減壓濃縮干燥得精制枇杷花總黃酮，含量為(73.95±1.96) rutin mg/g[14-15]。

1.4 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

采用微孔板法測定[16]，在96孔微孔板上加入110 μL PBS(pH 6.8，67 mmol/L)，10 μL樣品溶液，20 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育15 min，加入20 μL 4.0 mmol/LpNPG，混勻，37 ℃恒溫反應15 min，于405 nm測吸光度，平行3次。以阿卡波糖為陽性對照，按照公式(1)計算抑制率。

(1)

式中：Ac,PBS代替樣品的反應體系吸光度；Ab,PBS代替樣品和酶的反應體系吸光度；AS,樣品組的反應體系吸光度；Ad,PBS代替酶的反應體系吸光度。

1.5 α-淀粉酶的抑制活性

采用微孔板法測定[17]，依次加入樣品溶液120 μL，120 μL 10 U/mL α-淀粉酶溶液，振蕩混勻，加入120 μL已于37 ℃預溫5 min的10 g/L可溶性淀粉溶液，混勻，37 ℃反應15 min，立即加入200 μL DNS顯色，沸水浴5 min，冰水冷浴5 min，加入1 040 μL PBS至1 600 μL，于540 nm測定吸光度，平行3次。以阿卡波糖為陽性對照，按照公式(1)計算抑制率。

1.6 對α-葡萄糖苷酶抑制動力學試驗

參考文獻[18-19]，在pNPG濃度為4.0 mmol/L，在3組質量濃度下(枇杷花醇提取物為0、5、10 g/L；枇杷花總黃酮為0、0.026 1、0.052 2 g/mL)，分別測定不同α-葡萄糖苷酶活力時的酶促反應初速度，以酶活力(U/mL)為橫坐標，反應初速度V0[μmol/(L·min)]為縱坐標作圖，判斷可逆或不可逆抑制類型。

固定α-葡萄糖苷酶活力為0.1 U/mL，在3組質量濃度下(枇杷花醇提取物為0、5、10 g/L；枇杷花總黃酮為0、0.026 1、0.052 2 g/mL)，測定不同pNPG濃度反應體系的反應速率，橫坐標為pNPG濃度的倒數(1/[S])，縱坐標為反應初速度的倒數(1/V0)繪制Lineweaver-Burk 曲線，判斷其是競爭性抑制、非競爭性抑制抑或反競爭性抑制類型。

1.7 對α-淀粉酶抑制動力學試驗

參考文獻[20]的方法，在10 g/L可溶性淀粉溶液，在3組質量濃度下(枇杷根為0、1.5、3 g/L；枇杷花總黃酮為0、0.78、1.57 g/L)，分別測定不同α-淀粉酶活力反應體系下的反應初速率，以酶活力為橫坐標、反應初速率mol/(L·min)為縱坐標作圖，判斷其可逆或不可逆抑制類型。

固定α-淀粉酶活力10 U/mL，在3組質量濃度下(枇杷根為0、1.5、3 g/L；枇杷花總黃酮為0、0.78、1.57 g/L)，測定其在不同淀粉質量濃度(0.312、0.625、1.25、2.5、5、10 g/L)反應體系下的反應初速率，以底物質量濃度的倒數(1/[S])為橫坐標、反應初速率的倒數(1/V0)為縱坐標繪制Lineweaver-Burk曲線，判斷其是競爭性抑制、非競爭性抑制抑或反競爭性抑制類型。

1.8 統計學處理方法

實驗重復3次，通過Origin 8.5軟件進行數據處理并作圖，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

由圖1可知，枇杷不同藥用部位醇提取物均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，在一定質量濃度范圍內，抑制率隨質量濃度的增大而增強，呈現一定的量效關系。

圖1 樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.1 The α-glucosidase inhibition of sample

枇杷不同藥用部位和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性強弱依次為：阿卡波糖>枇杷花>枇杷莖>枇杷根>枇杷葉>枇杷果肉>枇杷種子，半抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)值分別為：阿卡波糖(2.46±0.16)g/L，枇杷花(4.65±0.35)g/L，枇杷莖(6.40±0.74)g/L，枇杷根(7.27±0.64)g/L，枇杷葉(15.07±1.04)g/L，枇杷果肉(120.06±2.33)g/L，枇杷種子(179.20±2.95)g/L。枇杷花對α-葡萄糖苷酶的抑制效果與阿卡波糖較為接近，且強于其他藥用部位。我國枇杷花資源豐富，食用藥用歷史悠久，據統計，我國枇杷栽種面積達11萬hm2，為全球之最，但在疏花過程導致70%的枇杷花資源的浪費[21]。枇杷花可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑資源應用于降血糖功能食品的開發。

2.2 α-淀粉酶抑制活性

由圖2可知，枇杷不同藥用部位均具有α-淀粉酶抑制活性，在一定質量濃度范圍內，抑制率隨質量濃度的增大而增強，呈現一定的量效關系。枇杷不同藥用部位和阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制活性強弱依次為：阿卡波糖>枇杷根>枇杷莖>枇杷花>枇杷葉>枇杷果肉>枇杷種子，IC50值分別為：阿卡波糖(0.11±0.06)g/L，枇杷根(1.51±0.24)g/L，枇杷莖(12.26±0.56)g/L，枇杷花(14.41±0.59)g/L，枇杷葉(30.30±1.12)g/L，枇杷果肉(48.81±1.53)g/L，枇杷種子(237.16±2.67)g/L。枇杷根對α-淀粉酶的抑制效果強于其他藥用部位。枇杷不同藥用部位對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性強弱的次序不同，可能與其不同藥用部位的萜類、黃酮類成分含量差異有關，鄭美瑜等[22]研究發現枇杷花黃酮含量顯著高于葉和種子，曹紅云[23]研究發現枇杷根總萜物質含量高于枇杷葉。故實驗進一步探究枇杷花醇提取物對α-葡萄糖苷酶以及枇杷根醇提取物對α-淀粉酶抑制的酶促動力學特征。此外，對α-淀粉酶的過度抑制是導致胃腸脹不良反應主要因素之一，為此我們選取了α-葡萄糖苷酶抑制作用最強而對α-淀粉酶抑制作用較弱的枇杷花為原料，進一步探究枇杷花純化后的總黃酮對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制作用及其酶動力學特征。

圖2 樣品對α-淀粉酶的抑制效果Fig.2 The α-amylase inhibition of sample

2.3 枇杷花醇提取物對酶抑制類型的確定

2.3.1 枇杷花醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制類型

由圖3-a可知，當枇杷花醇提取物質量濃度為0 g/L，即未加抑制劑組，得到的反應速率直線經過原點；當枇杷花醇提取物質量濃度為5、10 g/L時，所得的直線均近似通過原點，且為10 g/L的直線的斜率低于5 g/L的直線的斜率，由此可得枇杷花醇提取物對α-葡萄糖苷酶為可逆性抑制。由圖3-b可知，當枇杷花醇提取物質量濃度為0、5、10 g/L，反應速率相對無抑制劑組明顯下降，隨著枇杷花醇提取物質量濃度的增大，反應速率越慢，且3條直線近似交于x軸的負半軸于同一點，即Km值不變，為2.60 mmol/L，但Vmax值變小，由此可得枇杷花醇提取物對α-葡萄糖苷酶為非競爭性抑制類型。該抑制類型與謝子玉[24]對枇杷花中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷抑制α-葡萄糖苷酶類型不同，由此推測枇杷花95%乙醇提取物中具有其他潛在成分對α-葡萄糖苷酶抑制活性及其結合方式起著重要作用，應進一步探究其潛在的活性成分及其成分間協同降血糖作用效果。

a-可逆、不可逆抑制類型的確定；b-競爭性、非競爭性、 反競爭性和混合型抑制類型的確定圖3 枇杷花醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制類型的確定Fig.3 Determination of α-glucosidase inhibitory type of E.japonica flower ethanol extract

2.3.2 枇杷根醇提取物對α-淀粉酶抑制類型

由圖4-a可知，當枇杷根質量濃度為0 g/L，即未加抑制劑組，得到一條經過原點的反應速率直線；當枇杷花質量濃度為1.5、3 g/L時，所得的直線均近似通過原點，且3 g/L的直線的斜率低于1.5 g/L的直線的斜率，由此可得枇杷根對α-淀粉酶為可逆性抑制。由圖4-b可知，當枇杷根質量濃度為0、1.5、3 g/L的3條線性擬合直線經過y軸的正半軸于同一點，即Vmax值不變，為5.90 mol/(L·min)，且隨著枇杷根質量濃度的增大，反應速率加快，由此可得枇杷根對α-淀粉酶屬于競爭性抑制類型，表明枇杷根95%乙醇提取物與淀粉競爭α-淀粉酶結合位點，從而達到延緩淀粉水解。該抑制類型與陽性對照阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制類型不同[25]，是一種潛在的新型α-淀粉酶抑制劑篩選資源。

a-可逆、不可逆抑制類型的確定；b-競爭性、非競爭性、 反競爭性和混合型抑制類型的確定圖4 枇杷根醇提取物對α-淀粉抑制類型的確定Fig.4 Determination of α-amylase inhibitory type of E.japonica root ethanol extract

2.4 枇杷花總黃酮對酶抑制活性及抑制類型的確定

2.4.1 枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性

由表1可知，枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有良好的抑制活性，對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值為(0.017 4±0.003 5) g/mL，低于枇杷花醇提取物的(4.65±0.35)g/L；對α-淀粉酶的抑制活性的IC50值為(1.57±0.03)g/L，低于枇杷花醇提取物的(14.41±0.59)g/L，即枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性顯著強于枇杷花醇提取物，表明經過超聲波提取和大孔樹脂純化能有效富集枇杷花中抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性組分。

2.4.2 枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制類型

由圖5-a可知，當枇杷花總黃酮質量濃度為0、0.026 1、0.052 2 g/L時，3組反應速率直線近似經過原點，由此可得枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶為可逆性抑制。由圖5-b可知，枇杷花總黃酮質量濃度為0、0.026 1、0.052 2 g/L的3組速率直線相交于橫軸負半軸的同一點，且Km值不變，為1.825 mmol/L，Vmax值隨著質量濃度的增大而減小，可判斷為非競爭性抑制類型。結合2.3.1結果可知，枇杷花總黃酮與枇杷花醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制類型一致，均為可逆非競爭性抑制類型。

表1 枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性Table 1 The α-glucosidase and α-amylase inhibition of total flavonoids from E.japonica flower

a-可逆、不可逆抑制類型的確定；b-競爭性、非競爭性、 反競爭性和混合型抑制類型的確定圖5 枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制類型的確定Fig.5 Determination of α-glucosidase inhibitory type of total flavonoids from E.japonica flower

2.4.3 枇杷花總黃酮對α-淀粉酶抑制類型

由圖6-a可知，當枇杷花總黃酮質量濃度為0、0.78、1.57 g/L時，3組反應速率直線近似經過原點，由此可得枇杷花總黃酮對α-淀粉酶為可逆性抑制。由圖6-b可知，枇杷花總黃酮質量濃度為0、0.78、1.57 g/L的3組速率直線相交于橫軸負半軸的同一點，且Km值不變，為1.536 9 g/L，Vmax值隨著質量濃度的增大而減小，可判斷為非競爭性抑制類型。

a-可逆、不可逆抑制類型的確定；b-競爭性、非競爭性、 反競爭性和混合型抑制類型的確定圖6 枇杷花總黃酮對α-淀粉酶抑制類型的確定Fig.6 Determination of α-amylase inhibitory type of total flavonoids from E.japonica flower

3 結論

本文系統比較研究了枇杷根、莖、葉、花、果肉、種子6個藥用部位95%乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性并對其最強活性部位的酶促反應動力學進行了分析。結果顯示，在枇杷不同藥用部位中，枇杷根醇提取物具有最強的α-淀粉酶抑制活性，IC50值為(1.51±0.24)g/L，對α-淀粉酶為可逆競爭性抑制類型，Vmax=5.90 mol/(L·min)；枇杷花醇提取物具有最強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值為(4.65±0.35)g/L，對α-葡萄糖苷酶為可逆非競爭性抑制類型，Km=2.60 mmol/L。枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性IC50分別為(0.017 4±0.003 5)、(1.57±0.03)g/L，強于枇杷花醇提取物，且對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制類型與枇杷花醇提取物一致，均為可逆非競爭性抑制類型。明確了枇杷不同藥用部位對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性差異，及其最強活性部位醇提取物和枇杷花總黃酮對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的結合方式。研究結果為枇杷作為α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑資源及其降血糖功能食品的開發利用提供了科學依據。