濃香型酒醅中梭菌群落演替及其與理化性質的相關性分析

胡曉龍，馮大鴻，張勇，遲雷，鄭燕，韓素娜，沈祥坤，魏濤*

1(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450001)2(河南仰韶酒業有限公司博士后科研工作站， 河南 三門峽，47240)3(河南省食品工業科學研究所有限公司，河南 鄭州，450053)

中國白酒根據釀造工藝、原料和風味特征等差異可將其分為濃香型、醬香型、清香型和米香型等多種香型[1]。其中濃香型白酒因其具有窖香濃郁、綿柔醇厚、香味協調、回味悠長的風格特點而深受廣大消費者的青睞[2]。酒醅是濃香型白酒釀造微生物的主要載體，微生物群落多樣性及組成是影響濃香型白酒獨特風味和品質的主要因素之一[3]。

近年來，高通量測序技術的廣泛應用極大地豐富了人們對白酒釀造微生物的認識。胡曉龍等[3]發現酒醅中微生物主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)等，其中厚壁菌門在酒醅和窖泥微生物中占絕對優勢，其相對豐度能達到50%以上。梭菌綱細菌(梭菌)是濃香型白酒釀造過程中一類重要的功能菌，隸屬于厚壁菌門，具有多種代謝活動，包括將淀粉轉化為己酸(己酸乙酯的前體物質)、丁酸、醇等[4]。早在20世紀60年代梭菌就被認為是濃香型白酒重要風味物質己酸乙酯的重要貢獻菌[5]。近年來已經從不同酒企的窖泥中分別分離得到克魯氏梭菌(Clostridiumkluyveri)[6]、耳蝸形梭菌(C.luticellarii)[7]和丁酸梭菌(C.butyrieum)[8]等，并證明和產己酸、丁酸密切相關。盡管梭菌是酒醅中的優勢微生物之一，但是目前關于梭菌的研究主要集中在窖泥樣品及梭菌的代謝物分析中[9-11]，而對酒醅樣品中梭菌群落多樣性及其演替規律研究鮮有報道。

因此，本研究采用高通量測序技術結合實時熒光定量方法對酒醅梭菌群落的多樣性、組成及其含量動態變化進行解析。同時，通過結合酒醅理化性質的變化，探索了梭菌群落和酒醅理化性質的關聯性，有助于進一步揭示梭菌群落在整個釀造周期內的演替規律及其影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集：隨機選取正常發酵的3口平行窖池，對每口窖池中發酵第3、7、15、25、45、60天的酒醅進行跟蹤取樣。對每口窖池下層(距窖底約50 cm)平面上任一對角線的1/2、1/4及其距窖壁20 cm處3個不同位置的酒醅分別采集并混勻作為該窖池的代表性酒醅樣品。因此，本研究共選取了18個樣品，采集完成后裝入已標記編號的無菌袋中并保存于-30 ℃備用，其編號分別為B3-1、B3-2、B3-3、B7-1、B7-2、B7-3、B15-1、B15-2、B15-3、B25-1、B25-2、B25-3、B45-1、B45-2、B45-3、B60-1、B60-2、B60-3。以編號B3-1、B3-2、B3-3為例，其中B代表下層酒醅，第一個數字3代表發酵時間為3 d，-1、-2和-3代表3個平行樣品。

主要試劑：濃硫酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、KCl、亞硝基鐵氰化鈉、NaClO、NH4Cl，天津市科密歐化學試劑有限公司；K2Cr2O7，天津市安吉瑞化工有限公司；酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、(NH4)2SO3，上海生工生物工程有限公司；DNS，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1.3 實驗方法

1.3.1 酒醅理化測定

含水量測定：采用105 ℃干燥箱烘干恒重法測定。pH檢測：將酒醅按料液比1∶3(g∶mL)與超純水混合均勻，然后用pH計檢測。還原糖、乙醇、銨態氮、總酸、總酯均參照文獻[12] 的方法進行測定。

1.3.2 酒醅樣品DNA提取

按照Powersoil?DNA Isolation Kit 試劑盒說明書提取酒醅DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA質量。

1.3.3 酒醅DNA檢測

使用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增合格總DNA樣品，并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。

1.3.4 生物信息分析

中期制度改革建議：在已經實施的共有產權、租賃房、集體土地建租賃房等新住房政策基礎上，筆者建議，優化新時代上海市住房金融結構及其相應制度，縮小按揭貸款占比，新增住房租賃貸款并且擴大占比，從住房金融結構優化和制度完善上有效降低新時代上海市住房金融杠桿率。

首先使用Trimmomatic v0.33軟件對測序得到的Raw Reads進行過濾，然后使用cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的高質量Reads；使用 FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品高質量的Reads進行拼接，得到的拼接序列即Clean Reads；使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據(effective reads)。其中相似性≥97%的序列歸為1個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，將OTU代表序列與Silva數據庫進行比對和物種注釋。挑選梭菌綱細菌結果用于后續分析。

1.3.5 實時熒光定量PCR

以細菌通用引物 對27F/1492R擴增菌株ClostridiumbutyricumD9(本實驗室保存)的16S rRNA序列全長，將該PCR擴增產物連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌JM109，培養后挑選出陽性克隆子。提取陽性克隆子質粒測定其吸光值并換算為質?？截悢?copies)，10倍梯度稀釋為DNA模板。采用細菌通用引物對515F/806R和梭菌引物對SJ-F/SJ-R分別對上述模板進行實時熒光定量PCR擴增，以lg(copies/μL)為橫坐標，對應的Ct值為縱坐標，分別繪制細菌和梭菌的熒光定量標準曲線，其中細菌和梭菌熒光定量PCR擴增體系及條件分別參照文獻[13]和 [14]的方法。

以每個酒醅樣品的DNA為模板利用上述引物和方法并測定其Ct值，分別根據細菌和梭菌熒光定量標準曲線計算每個樣品中的細菌及梭菌的含量。

1.3.6 數據處理

使用SPSS 26進行理化因子顯著性分析，選擇Duncan’s多重比較方法，不同小寫字母表示處理之間存在顯著差異(P<0.05)。Shannon指數的計算如公式(1)所示。

(1)

式中：H，Shannon多樣性指數；s，微生物屬的總數；Pi，第i個屬的數量占總數的比例。

柱狀圖、標準曲線均使用Origin 9.0繪制。采用HemI軟件繪制熱圖，Canoco 5軟件繪制主成分分析(principal component analysis，PCA)圖和冗余分析(redundancy analysis， RDA)圖。Shannon指數箱線圖和相關性熱圖使用TUtool云平臺完成。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

如表1所示,根據發酵過程中酒醅的溫度變化可以將整個發酵周期分為3個階段，即升溫期(3～7 d)、穩定期(7～25 d)和降溫期(25～60 d)，這與HU等[15]的研究結果一致。這主要是由于發酵前期酒醅營養充足，有利于微生物的生長繁殖，從而產生大量發酵熱[16]。隨著發酵時間的延長，酒醅中的營養成分逐漸減少，微生物生長和代謝減緩，酒醅溫度在34 ℃保持18 d左右。在發酵后期，酒醅中可利用養分基本耗盡，加上乙醇和酸的增加，部分不適應環境的微生物逐漸死亡或者休眠[17]，發酵作用和微生物活動均減小，酒醅溫度下降。

在發酵前7 d，酒醅中除含水量下降外，其余理化指標均上升；在發酵7～25 d，乙醇、總酸含量和含水量上升，還原糖和總酯含量開始下降銨態氮略微上升后下降；在發酵25～60 d，含水量和總酸均在45 d時達到最大值，分別為(63.76±3.43)%和(24.63±2) mg/g，然后下降，銨態氮和總酯在45 d時略微上升而后下降；還原糖和pH則在45 d時下降至最低值 (6.08±5.82) mg/g和 3.36；乙醇在45 d時略微下降，然后在60 d時升至最高值(126.42±10.37) mg/g。酒醅pH在發酵前45 d均呈現下降趨勢，發酵結束時略有回升。在發酵過程中，水分是保障酒醅中微生物生長代謝的重要因素，并為其代謝產物提供有效溶劑[18]。還原糖含量能間接反應白酒的發酵進程[19]，發酵開始時，原料中的淀粉被分解為還原糖，但此時微生物生長代謝尚不活躍，對還原糖的利用率還不高，導致其含量積累增加，隨著發酵進行不斷減少直到發酵結束。乙醇是白酒發酵的重要產物，平均生成速率為0.57 mg/(g·d)，其質量分數在3～7 d時增加最快，為2.11 mg/(g·d)，在發酵至45 d時略微減少，這主要是由于在發酵后期酸和醇等合成脂類的前體物質大量積累，進而發生酯化反應生成酯類，加上酒醅含水量增加，稀釋了乙醇的濃度，導致乙醇減少。另外在封閉的發酵環境中，微生物不斷代謝積累有機酸，酒醅中總酸快速上升，pH開始下降。

表1 不同酒醅樣品中理化性質變化Table 1 Changes of physicochemical properties in different Jiupei samples

2.2 梭菌群落α多樣性分析

Shannon指數可以用來表示酒醅中物種多樣性，指數越大，多樣性越高。如圖1所示，梭菌Shannon指數的范圍在0.01～0.27，呈現先減少(3～7 d)，后穩定(7～25 d)，增加(25～45 d)，再下降(45～60 d)的趨勢，梭菌群落的多樣性在不斷發生變化，且在第7天達到最低，第45天最高，這可能與酒醅中氧含量有關。在發酵前7 d，酒醅中氧含量較多，有利于芽孢桿菌等好氧菌的生長繁殖；在發酵中后期(25～45 d)，酒醅溶氧量被消耗，更適合于梭菌等厭氧菌的生長，同時好氧菌生物量減少，進而導致梭菌群落多樣性顯著增加。

圖1 不同酒醅樣品中梭菌群落Shannon指數變化Fig.1 Shannon index of clostridial community in different Jiupei samples注：*代表具有顯著變化(P<0.05)

2.3 酒醅中梭菌群落β-多樣性解析

在屬水平上，共注釋到39個梭菌綱中的屬?；谏鲜?9個屬進行PCA，探究不同發酵節點之間梭菌的群落差異，結果如圖2所示。18個樣品整體上可分為4類，即3、45、60 d的樣品分別聚為一類，7、15、25 d樣品聚在一起，每一類樣品之間具有類似的梭菌群落。由此可知，酒醅梭菌群落變化與發酵時間有較好的關聯性，其中發酵3、45、60 d的酒醅分別具有獨特的梭菌群落，而7、15、25 d酒醅具有相似的梭菌群落。盡管不同發酵時間的酒醅梭菌群落能區分開，但是B3平行樣品之間具有較大的離散度，這可能是由于：白酒釀造實際生產中的物料混合(大曲、糧食、酒醅等)多為人工拌和，很難保證不同平行窖池中物料拌勻程度完全一致，這也導致不同平行樣品之間接入的微生物群落自身存在差異；此外，白酒釀造為固態發酵，平行樣品間的酒醅微環境(如酒醅營養成分含量、含水量和溶氧等)可能也會存在差異，使得平行窖池之間酒醅微生物發酵進度不一，進而導致部分平行樣品不能很好地聚類[20-21]。

圖2 不同酒醅樣品中梭菌組成的PCA圖Fig.2 PCA plot based on the clostridia community structures in different Jiupei samples

2.3.1 酒醅梭菌群落組成

根據分類學注釋結果(圖3-a)，酒醅中共檢測到6個優勢菌綱(>1%)：Bacilli(芽孢桿菌綱，平均相對豐度78.12%)、Gammaproteobacteria(γ-變形菌綱，5.96%)、Bacteroidia(擬桿菌綱，5.33%)、Alphaproteobacteria(α-變形菌綱，2.97%)、Clostridia(梭菌綱，1.71%)和Actinobacteria(放線菌綱，1.11%)。其中Clostridia由1個目、13個科和39個屬組成。

在目水平上，僅鑒定到單一的Clostridiales(梭菌目)。在13個科中，平均相對豐度>0.1%的科有Ruminococcaceae(瘤胃菌科，0.71%)、Clostridiaceae(梭菌科，0.35%)和Lachnospiraceae(毛螺菌科，0.35%)。表明在酒醅發酵過程中梭菌變化主要集中在上述3個科，與錢瑋等[10]的結果一致。在屬水平上，共檢測到39個可鑒定的屬，平均相對含量>0.1%的僅有Caproiciproducens(己酸菌屬0.4%)和Clostridium_sensu_stricto_1(狹義梭菌屬1，0.1%)。與窖泥中梭菌相比[10]，酒醅中的梭菌群落多樣性較低，所檢測到的梭菌數量較少，如常見的Heliobacteriaceae(太陽桿菌科)在酒醅中也并未檢測到。導致這一結果的原因可能有：酒醅中乳桿菌的相對豐度較高，其主要終產物乳酸會抑制沒有耐酸特性的梭菌生長，加上乳酸鏈球菌素和乳酸菌素等細菌素會抑制革蘭氏陽性菌的生長，導致酒醅中梭菌較少[14,22]；本研究使用細菌通用引物進行測序分析，可能會因其擴增偏好性導致部分梭菌或含量低梭菌的無法檢測到[23]。

2.3.2 酒醅梭菌群落組成的演替規律

梭菌的平均相對豐度為0.12%～5.58%，在發酵過程中呈先減少(3～25 d)后增加(25～45 d)再減少(45～60 d)的趨勢。在發酵第7天含量最低(0.12%)，其次為15 d和25 d，在發酵45 d時占比最高(5.58%)(圖3-b)。在科水平上，Ruminooccaceae(0.71%)和Clostridiaceae(0.35%)和Lachnospiraceae(0.35%)為主要優勢科，其總平均相對豐度占梭菌綱的73.18%。酒醅梭菌群落的變化主要由上述3個科驅動，其中Ruminococcaceae在前25 d呈現減少的趨勢，在發酵25～45 d大幅增加，隨后又減少。Clostridiaceae呈現和Ruminococcaceae相反的規律。Lachnospiraceae則呈現不穩定的變化過程。

a-細菌綱水平；b-梭菌綱水平圖3 不同酒醅樣品中細菌綱和梭菌綱水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria and clostridia at class level in different Jiupei samples

在屬水平上，挑選相對豐度前20個梭菌綱中的屬進行熱圖分析(圖4)。聚類分析結果表明，整個發酵過程可分為3類，B3為①類，B7、B15和B25為②類，B45和B60為③類。說明在發酵過程中，梭菌會隨著發酵時間發生整體性的變化，也與圖2的結果存在一定的一致性。在發酵7～25 d，所有梭菌的相對豐度均不同程度地減少，發酵至45 d時，除Saccharofermentans(產乙酸糖發酵菌)和Acetanaerobacterium(延長厭氧醋菌)外，其余18個屬的相對含量均增加，其中，Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_1、Sedimentibacter、Fonticella、Anaerofilum、Ruminiclostridium_1(瘤胃梭菌屬1)和Butyrivibrio_2(丁酸弧菌屬2)的相對豐度在發酵至45 d時增加至最高。在這7個屬中，Caproiciproducens含量最多，達到2.29%。GAO等[24]研究發現Caproiciproducens為濃香型白酒窖泥中的主要產己酸細菌，因此推測該屬中的某些物種在酒醅中合成己酸起著重要的作用。

圖4 不同酒醅樣品中梭菌屬水平組成Fig.4 Clostridial composition in different Jiupei samples at the genus level

2.4 梭菌熒光定量分析

實時熒光定量PCR結果進一步研究了發酵過程酒醅中梭菌綱微生物的基因拷貝數以及在總細菌中的占比變化(圖5)。以濃度對數為橫坐標，Ct值為縱坐標，擬合繪制總細菌拷貝數標準曲線為：y=-3.033 3x+39.561，R2=0.997 3，梭菌綱拷貝數標準曲線為：y=-3.093 2x+37.519，R2=0.998 7，標準曲線均繪制良好。按上述標準曲線計算各樣本中總細菌及梭菌微生物的16S rRNA基因拷貝數(圖5-a)，梭菌綱的基因拷貝數呈現先減少后增加的動態變化，第25天時最低(基因拷貝數為5.21 lg個/g窖泥)，第45天升至最高(7.13 lg個/g窖泥)，發酵結束時(6.01 lg個/g窖泥)較發酵開始時有所減少。這也與16S rRNA所得梭菌相對含量的變化規律一致。通過定量發現酒醅中梭菌和總細菌的基因拷貝數比值為0.17%～4.28%(圖5-b)，與16S rRNA測序結果類似，梭菌的占比同樣在發酵45 d時最高。

a-熒光定量結果；b-基因拷貝數比值圖5 不同酒醅樣品中總細菌及梭菌綱細菌實時 熒光定量結果Fig.5 Real-time PCR results of total contents of bacteria and clostridia in different Jiupei samples

2.5 理化因子與梭菌之間的相關性

RDA展示了酒醅中相對豐度前10的梭菌(平均相對豐度>0.04%)與理化因子之間的關系(圖6-a)，2個主成分的總解釋度為64.68%，主要集中Aixs1(59.76%)(圖6-a)。理化因子與梭菌之間的相關性貢獻率由大到小依次為溫度(45.5%)>含水量(17.8%)>銨態氮(11.0%)>還原糖(10.3%)>乙醇(8.0%)>pH(5.2%)>總酯(1.5%)>總酸(0.6%)，其中溫度與梭菌群落結構呈極顯著關系(P<0.01)。不同發酵節點的酒醅樣品能有效地被區分開來，再次說明酒醅中梭菌群落的變化受到發酵時間的影響，同時也受酒醅理化性質的影響。18個酒醅樣品分布在不同的象限，例如，發酵3 d和7 d的樣品分別存在于第1和第2象限中，與銨態氮、總酯、pH和還原糖呈現較強的正相關；第3象限主要有發酵15 d和25 d的樣品，與溫度呈正相關；發酵45 d和60 d的樣品主要在第4象限，與乙醇、總酸和含水量呈正相關。綜上，在不同的發酵節點酒醅中驅動梭菌群落變化的理化因子不一樣，溫度、含水量和銨態氮是影響較大的環境因子。

通過計算相對豐度前10的梭菌和理化因子之間的Pearson相關性系數進一步分析酒醅理化因子對梭菌的影響。如圖6-b所示，除Christensenellaceae_R-7_group外，其他9個梭菌均與總酸和含水量呈正相關。其中，總酸與Caproiciproducens、Fonticella、Anaerofilum和Butyrivibrio_2呈顯著正相關(0.01

a-RDA；b-Pearson相關性分析圖6 理化因子與梭菌前10屬相關性分析Fig.6 The correlation analysis between the top 10 genera of Clostridia and physicochemical factors in Jiupei samples注：*:0.01

3 結論

本研究中，供試酒醅樣品梭菌群落由39個梭菌綱中的屬組成，梭菌群落的相對豐度在發酵至7 d時減少，然后保持穩定至25 d，在25～45 d發酵中又增加，然后減少至發酵結束。其群落Shannon指數、豐度和基因拷貝數均在發酵45 d達到最高。在梭菌群落的演替過程中，Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_1主要的優勢梭菌。RDA結果表明，在發酵3～7 d，銨態氮、總酯、pH和還原糖是驅動梭菌演替的主要因素；發酵15～25 d時溫度成為了主要的驅動因素；到發酵45～60 d乙醇、總酸和含水量成為新的影響因素。Pearson相關性分析表明，總酸和含水量具有較大影響，溫度與相對豐度前10的梭菌呈負相關，pH僅與Christensenellaceae_R-7_group呈正相關，與Caproiciproducens呈顯著負相關。乙醇、總酯、還原糖對梭菌群落均無顯著性影響?？偟膩碚f，盡管高通量測序能全面地認識酒醅中梭菌的多樣性，但由于使用細菌通用引物導致梭菌信息丟失導致梭菌數量較少。在進一步的研究中，應考慮設計使用梭菌特異性引物，并選擇更深層次的測序方法檢測酒醅中梭菌的具體代謝途徑及產物。