牙周病中固有淋巴細胞的研究進展

成益凡 秦旭 姜鳴 朱光勛

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院口腔科 武漢 430030

固有淋巴細胞（innate lymphoid cells，ILCs）是一群具有適應性免疫功能，但不表達T淋巴細胞或者B淋巴細胞抗原特異性受體的固有免疫細胞。ILCs來源于共同淋巴祖細胞（common lymphoid progenitor，CLP），CLP在DNA 結合抑制因子2（inhibitor of DNA binding 2，ID2）的調控下分化為共同固有淋巴祖細胞（common innate lymphoid progenitor，CILP），CILP繼續向下游分化，形成自然殺傷祖細胞（natural killer cell progenitor，NKP）和共同輔助固有淋巴細胞前體（common helper innate lymphoid progenitor，CHILP），CHILP進一步分化為淋巴組織誘導細胞（lymphoid tissue-inducer，LTi）、調節性固有淋巴細胞（regulatory innate lymphoid cells，ILCregs）和固有淋巴細胞前體（ILC precursor，ILCP），最后ILCP和NKP在不同的轉錄因子調控下分化為ILC1、ILC2、ILC3、自然殺傷（natural killer，NK）細胞，并使得它們具有不同的功能[1-4]。ILCs多為組織駐留淋巴細胞，主要分布于肺、胃腸道組織等黏膜屏障部位[5]。ILCs在早期抵御病原體入侵中發揮關鍵作用，并且參與受損組織的修復，上皮屏障的維護和淋巴器官的形成，在肺、胃腸道組織中已經得到廣泛研究[6-7]。牙周病是菌斑微生物和宿主免疫保護機制相互作用的結果，主要致病因素是通過調控宿主保護性或破壞性免疫反應促進牙周病的發生和發展[8]。有研究[9-10]表明：ILCs也存在于健康和炎癥牙周組織（包括牙齦和牙周韌帶）中，不同亞型ILCs主要通過調控牙周組織的骨代謝、免疫炎癥反應以及組織修復方面參與牙周病的發生發展，進一步闡述和證明了牙周病和ILCs的相關性。本文就ILCs在牙周病中的研究進展進行綜述。

1 ILCs的分類與功能特點

1.1 ILCs的分類

通常根據ILCs表達的轉錄因子、分泌的細胞因子和功能特點的不同，將其分為3型：Ⅰ型ILCs、Ⅱ型ILCs和Ⅲ型ILCs[6]。隨著對ILCs分化和發育研究的不斷深入，根據ILCs的表型特征和功能差異，可將其分為6個細胞亞群，即NK細胞、ILC1、ILC2、ILC3、LTi和ILCregs[4,6]。

ILC1s包括ILC1和NK細胞，后者根據細胞毒性可分為2個亞群：低細胞毒性CD56brightCD16-NK細胞和高細胞毒性的CD56lowNK細胞[11]。

ILC2s即ILC2，可以根據細胞因子受體表達模式的不同，分為2個細胞亞群：自然性ILC2s（natural ILC2s，nILC2s） 和炎癥性ILC2s（inflammatory ILC2s，iILC2s）[12]。

ILC3s包括ILC3和LTi，而ILC3根據其是否表達自然細胞毒性受體（natural cytotoxicity receptor，NCR） 分為2類：NCR+ILC3s和NCR-ILC3s[5]。ILC3s根據其是否表達趨化因子受體6（chemokine receptor 6， CCR6） 分 為 2 類 ， 即 CCR6+ILC3s 和CCR6-ILC3s。 CCR6+ILC3s 即 為 LTi 細 胞 ， 而CCR6-ILC3s可以根據是否表達NKp46（NCR的一種，在人和小鼠中均表達）分為2類，即CCR6-NKp 46+ILC3s和CCR6-NKp46-ILC3s[13]。ILC3s根據其是否表達NKp44（NCR的一種，在人類中表達）還可以分為NKp44+ILC3s和NKp44-ILC3s[14]。

1.2 ILCs的功能特點

1.2.1 Ⅰ型ILCs Ⅰ型ILCs包括NK細胞和ILC1。NK細胞在發育過程中受轉錄因子T-bet和脫中胚蛋白（eomesodermin，Eomes）的調控，分泌穿孔素、顆粒酶、細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ） 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）[15]。NK細胞高表達穿孔素，有細胞溶解活性，可以直接殺傷靶細胞，還可以通過分泌細胞因子參與早期炎癥反應，調節其他免疫細胞活性。NK細胞在抗病毒感染和抗腫瘤方面發揮重要作用[16]。ILC1發育過程中嚴格依賴于轉錄因子T-bet，分泌IFN-γ、TNF-α[17]。ILC1低表達穿孔素，沒有或者有很弱的細胞溶解活性，主要參與機體抗寄生蟲以及胞內細菌的感染[18]。

1.2.2 Ⅱ型ILCs Ⅱ型ILCs在生長發育過程中的關鍵調控因子為維甲酸相關孤兒受體α（retinoidrelated orphan receptor α，ROR α） 和GATA結合蛋白3 （GATA binding protein 3，GATA3）[19]。nILC2s聚集在健康組織中，表達腫瘤發生抑制因子2（suppressor of tumorigenicity 2，ST2），并低表達殺傷細胞凝集素樣受體G1（killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1）。iILC2s不表達表面分子ST2，在炎癥感染的刺激下可高表達KLRG1和白細胞介素 （interleukin，IL） -25受體[12]。ILC2s在IL-25、IL-33（炎癥刺激下，ILC2s可自分泌IL-33）及胸腺基質淋巴細胞生成素（thymicstromal lymphopoietin，TSLP）等刺激下分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子，保護宿主免受多種微生物（如寄生蟲、細菌、病毒）的侵害，并且通過產生雙調蛋白（amphiregulin，AREG）參與損傷組織修復[20-21]。

1.2.3 Ⅲ型ILCs Ⅲ型ILCs包括ILC3和LTi。ILC3和LTi的發育過程中均依賴于轉錄因子RORγt[22]。ILC3在IL-1β和IL-23的刺激下分泌IL-17、IL-22等細胞因子，在宿主的慢性炎癥、抗菌免疫和組織修復過程中發揮重要作用[23]。LTi也可分泌細胞因子IL-17、IL-22，在胎兒發育過程中即開始發揮作用，并且在淋巴結的形成和黏膜相關的淋巴組織的發育中有重要作用[24]。

1.2.4 ILCregs ILCregs是近年來發現的一種存在于人和鼠腸道中的ILCs新亞群。在ILCregs的發育過程中起關鍵作用的是ID3。ILCregs通過分泌IL-10抑制ILC1s和ILC3s活化以減輕二者引起的促炎反應；也可以通過自分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） 以維持和擴增ILCregs的數量[4]。

2 牙周組織中的ILCs及其在牙周病中的作用

2.1 牙周組織中的ILCs

已有研究[9,25-27]報道：各亞型ILCs均存在于健康和炎癥牙周組織（包括牙齦和牙周韌帶）中，但在健康和炎癥牙周組織的分布存在差異，且差異有統計學意義。另外，健康牙周組織中富集的ILCs亞型主要為ILC1s[27]。在體內、外實驗中均發現：炎癥牙周組織的各型ILCs均增加，但其數量變化顯著的ILCs類型仍有爭議。筆者所在課題組的研究[9]證明：在小鼠牙周炎模型中，ILCs數量變化最明顯的亞型是ILC2s。Li等[10]報道：ILC1s和ILC3s是人炎癥牙周韌帶富集的主要亞群，尤其是NKp44+ILC3s 亞群。雖然NKp44+ILC3s 僅占總ILC3s的5%，但與健康牙周韌帶相比，炎癥牙周韌帶中NKp44+ILC3s數量明顯增加。Kindstedt等[26]報道：在來源于人體牙齦炎和牙周炎的牙齦組織樣本中，其富集的ILCs類型為ILC1s。在牙齦炎中發現ILCs各個亞型分布為ILC1s、ILC2s、NCR-ILC 3s和NCR+ILC3s占比分別為60%、7%、27%和6%；在牙周炎中發現ILCs各個亞型分布有所不同，ILC1s、ILC2s、NCR-ILC3s和NCR+ILC3s的占比分別為68%、9%、18%和4%。上述研究結果不一致可能與使用的樣本不同有關。

2.2 ILCs在牙周病中的作用

2.2.1 Ⅰ型ILCs（NK 細胞和ILC1） NK細胞可能參與牙周組織的免疫炎癥反應。有研究[28]報道了NK細胞在牙周炎中發揮促炎作用的機制，主要包括以下方面，即NK細胞通過細胞毒性反應、分泌趨化因子和細胞因子、調控B細胞和T細胞、上調自身免疫反應、與樹突狀細胞相互作用等，從而發揮促炎作用。還有研究[28-29]表明：NK細胞數量、表型與牙周狀態之間存在相關性。在小鼠牙周炎模型和體外實驗[29]中，均發現NK細胞和牙周病相關病原體具有相互作用，這可能增加IFN-γ和TNF-α的分泌，進而影響牙周病的發生發展。有研究[28]發現：NK細胞可能通過下調自身免疫調控B細胞、T細胞、樹突狀細胞的免疫反應，從而在牙周病中發揮免疫調節作用。NK細胞在牙周病中具體的免疫調節機制尚不清楚，還需進一步研究探討[28]。

ILC1s可能參與牙周組織的免疫炎癥反應和骨代謝。與野生型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠牙周組織的ILC1s數量增加[9]。體外實驗[10]中，與健康牙周韌帶相比，炎癥牙周韌帶中ILC1s數量也同樣增加。用豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-2-myristate-13-acelale，PMA）/離子霉素刺激從健康和炎癥牙周韌帶分離出的ILC1s，發現在炎癥牙周韌帶來源的ILC1s中，IFN-γ的表達明顯增加[10]。為了模擬激活ILCs的生理條件，用IL-12刺激從健康和炎癥牙周韌帶分離出的ILC1s，發現炎癥牙周韌帶來源的ILC1s分泌更多的IFN-γ[10]。研究[26]報道：在一小部分ILC1s上檢測到核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）的表達。RANRL在牙齦炎和牙周炎中表達的ILCs亞型主要是ILC1s。ILC1s有可能通過表達RANKL從而有助于破骨細胞的形成和骨吸收，但是其具體機制并不清楚，無法確定ILCs在牙周組織中發揮骨改建的作用在多大程度上與ILC1s表達RANKL有關[26]。

2.2.2 Ⅱ型ILCs（ILC2s） ILC2s可能參與牙周組織的免疫調節。筆者所在課題組的研究[9]表明：通過敲除小鼠腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）基因，可以明確AMPK基因可促進ILCs，尤其是ILC2s在小鼠牙周組織中的浸潤，減少IL-5、IL-33以及IL-13mRNA的表達，從而調節牙周組織的免疫反應。該研究[9]還發現：野生型和AMPK敲除型健康小鼠牙周組織中ILCs各亞型比例相似。與相應兩型的健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中ILCs均明顯增加，其中數量變化最明顯的ILCs亞型均為ILC2s。另外，與野生型牙周炎小鼠相比，AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中 總 ILCs 和 ILC2s 增 加 均 更 明 顯[9]。 野 生 型 和AMPK敲除型健康小鼠牙周組織各細胞因子的表達相似。與相應兩型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中IL-33mRNA表達均顯著增加。另外，與野生型牙周炎小鼠相比，AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中IL-33mRNA的表達增加更明顯[9]。除此之外，與相應兩型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠牙周組織中IL-5mRNA和IL-13mRNA的表達幾乎不變，而AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中IL-5 mRNA和IL-13 mRNA的表達增加[9]。與小鼠牙周炎模型和體外實驗結果相似，ILCs及其細胞因子在人炎癥牙周組織較健康牙周組織ILCs各亞型均增加，變化最明顯的是ILC2s，IL-5mRNA和IL-33mRNA表達均增加[9]。

2.2.3 Ⅲ型 ILCs（ILC3 和 LTi） ILC3s在牙周病中可能發揮著雙重作用。一方面，牙周韌帶中ILC3s可以通過分泌細胞因子IL-17促進牙周韌帶組織的局部免疫炎癥反應。與野生型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠牙周組織的ILC3s數量增加[9]。體外實驗[10]中，與健康牙周韌帶相比，炎癥牙周韌帶中ILC3s也同樣增加。用PMA/離子霉素刺激從健康和炎癥牙周韌帶分離出的ILC3s，發現在炎癥牙周韌帶來源的ILC3s中，IL-17的表達顯著增加。為了模擬激活ILCs的生理條件，用IL-23和IL-1β刺激從健康和炎癥牙周韌帶中分離出的ILC3s，發現在炎癥牙周韌帶來源的ILC3s中，IL-17的表達也同樣顯著增強[10]。另一方面，牙周組織中的ILC3s可能通過降低CCR6的表達從而抑制牙周炎癥。與相應兩型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中ILC3s增加。研究[9]發現：沒有使用IL-23和IL-1β刺激ILC3s時，與相應兩型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中CCR6的表達均降低；在IL-23和IL-1β的刺激下，與相應兩型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周組織中CCR6的表達均降低得更加明顯。ILC3s降低CCR6的表達可能反映了一種代償機制，即通過降低IFN-γ和IL-17的分泌潛力，同時增加IL-22的分泌，可以起到抑制炎癥反應的目的，但具體機制還需進一步研究[9]。

3 小結與展望

綜合上述研究可以看出，各型ILCs均存在于健康和炎癥牙周組織中，并且參與了牙周病發生發展的進程?？偨Y來說，不同亞型ILCs在牙周病的炎癥應答、牙周骨代謝、組織修復中發揮著不同的作用。1）Ⅰ型ILCs：NK細胞參與牙周組織的免疫炎癥反應，還可能參與牙周組織的免疫調節；ILC1通過分泌IFN-γ參與牙周的免疫炎癥反應，還可能通過表達RANKL參與牙周骨代謝。2）Ⅱ型ILCs：ILC2s通過分泌IL-5、IL-13、IL-33參與牙周組織的免疫調節。3）Ⅲ型ILCs：ILC3s發揮雙重作用，可以通過分泌IL-17促進局部免疫炎癥反應，還可能通過降低CCR6的表達抑制牙周炎癥。這些作用機制揭示了ILCs在牙周病的治療中具有潛在作用，有望成為牙周病新的治療靶點。

通過調節ILCs的活性或者其產生的效應分子有助于慢性炎癥性疾病的治療。在炎癥性腸病動物模型中，采用中和ILCs的方法（如抗CD90的單克隆抗體）能減輕腸道炎癥[30]。在小鼠結腸炎模型中，黃芩素可以通過ILC3s中芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）/IL-22通路改善潰瘍性結腸炎的癥狀[31]。然而，目前對于ILCs在牙周組織中的具體功能和分子機制尚未明確。一方面，ILCs的數量很少，選擇性分離很困難，難以單純研究ILCs的具體功能和分子機制。另一方面，現在還未發現ILCs各亞型的特異性標志，無法將這些特異性標志作為靶點而使治療策略具有特異性。由此可見，ILCs在牙周組織中的具體分子機制以及特異性藥物的開發還需進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。