湘西地區核桃堅果表型特征及多樣性研究

李建揮，李柏海 *，吳思政，柏文富，禹 霖，聶東伶，嚴佳文，熊 穎，向祖恒，彭先鳳

(1.湖南省植物園，湖南 長沙 410116；2.龍山縣林業局，湖南 龍山 416800)

核桃(Juglansregia)和泡核桃(J.sigillata)是胡桃科核桃屬中廣泛栽培的干果和油料樹種。我國是核桃生產大國，核桃產量占世界總產量的一半以上，有20個省(區、市)的1 000多個縣栽培核桃，主要產區為云南、新疆、陜西、四川、山西、河北、北京、天津、遼寧、山東等地。核桃種質資源是核桃產業可持續發展的基礎和保障，其主要包括核桃的栽培種、野生資源以及利用二者再創造的遺傳材料。我國最早培育的遼寧系列、中林系列、‘香玲’等核桃良種，就是以新疆早實核桃為親本與當地實生農家類型雜交選育而來。近年來，隨著核桃產業的不斷發展，實生農家類型和自然群體不斷流失和破壞，各地紛紛開展了核桃種質資源調查、收集和評價研究，以期摸清核桃種質資源的多樣性，為科學保護和開發利用提供依據[1-2]。

以表型性狀來檢測植物變異是一種直觀便捷的方法，能在一定程度上揭示物種遺傳多樣性[3]。核桃堅果表型特征是其表型性狀的直觀體現，直接反映區域內核桃資源的多樣性[4-5]。湖南省是核桃的天然分布區，核桃栽培有上百年的歷史[6]。該地區長期采用實生播種繁殖，樹體常為半野生狀態，使得核桃資源積累了較豐富的變異，形成了一定數量的實生類型群體，是核桃開發利用的寶貴材料。20世紀80年代末，何方等[6]對湖南省的核桃資源進行了調查研究，初步摸清了湖南省核桃資源、優良類型以及栽培歷史與現狀。之后，呂芳德團隊在湘西地區開展了核桃資源調查、經濟性狀測定以及堅果品質分析，選育出了一批優良單株[7-8]。王容等[9]比較了湘西北地區13個核桃樣品的堅果綜合品質，但由于采集的資源數量有限，鮮少涉及堅果表型特征研究，未能展現出該地區核桃資源的多樣性情況。本研究在湖南省核桃遺傳資源調查的基礎上，以湘西地區的223份種質資源為試材，測定了堅果表型的質量性狀和數量性狀，分析了該地區核桃資源的多樣性狀況，以期為湖南省開發利用核桃種質資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

湖南省西部是依據武陵山脈、雪峰山脈和云貴高原東側，沅水、澧水中上游及其支流匯聚的地理形勢自然形成的廣大地區(108°47′～112°10′E，26°38′～30°08′N)，常被統稱為湘西地區、湘西或大湘西，主要包括張家界市、湘西土家族苗族自治州、懷化市、邵陽市、常德市等[10-12]。該地區屬中亞熱帶季風濕潤氣候，氣候溫暖，降水充沛，光熱偏少，年均氣溫16～17 ℃，年降水量1 300～1 390 mm，年日照1 563.3 h[7]，地貌以山地、丘陵為主，土壤以紅壤、黃壤、石灰土為主，是核桃的自然分布區和適宜種植區[13]。

1.2 試材采集及性狀測定

在核桃和泡核桃資源分布集中區域，由當地林業部門工作人員做向導，實地走訪當地群眾，確定調查的核桃單株，記錄核桃樹體信息。9月中旬，核桃成熟時，每個單株收集50個核桃果實帶回實驗室，待核桃自然風干，測定堅果表型性狀。

堅果質量性狀參照GB/T 26909—2011《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南：核桃屬》[14]進行特征描述和賦值，測試指南中未描述的特征用“其他”表示，共選擇13個質量性狀。堅果數量性狀有8個，其中的單果質量與核仁質量用電子天平測量(精確度0.01 g)，出仁率=核仁質量/單果質量×100%；堅果大小用游標卡尺(精確度0.01 mm)測量，核殼厚度在切開堅果后，用游標卡尺測量其胴部位置(精確度0.01 mm)。堅果果形指數=(側徑+橫徑)/2倍縱徑，三徑均值=(縱徑+側徑+橫徑)/3。

1.3 數據處理

供試的223份核桃樣品來自湘西地區的4個縣、15個鄉鎮，采樣地信息和樣本數見表1，堅果表型特征賦值描述見表2。

表1 采樣地基本信息及樣本數Table 1 The ecological and geographical information and sample size of populations

表2 核桃和泡核桃堅果表型特征賦值及描述Table 2 The description and assignment of nut quality character for walnut accessions

運用Excel 2007計算表型性狀的平均值、標準差、變異系數和分布頻率等，繪制數量性狀頻率數據分布直方圖。進一步計算Simpson 指數、Shannon-Wiener 指數[15]、群體間和群體內方差分量及表型分化系數[16]等。用SPSS 19.0進行群體間堅果表型性狀變異系數多重比較，根據表型性狀平均值，采用組間連接法計算群體間的歐氏距離并進行聚類分析。采用GenAlEx 6.5對群體間歐氏距離與地理距離進行Mantel 檢驗[17]評估其相關性。

2 結果與分析

2.1 堅果表型性狀的多樣性分析

2.1.1 質量性狀的變異及分布

核桃表型質量性狀頻率分布及多樣性指數見表3，可以看出：核桃堅果表型質量性狀的變異系數為18.71%～79.21%，Simpson指數為0.171～0.823，Shannon-Wiener指數為0.450～2.760，說明湘西核桃質量性狀的多樣性較豐富。沿縫合線縱切面形狀圓形較多(30.94%)，心形最少(1.35%)，除核桃屬DUS測試指南規定的8種外，還出現了三角形、扁圓形、倒卵形3種其他類型(2.24%)；垂直縫合線縱切面形狀(種形)以圓形較多(30.04%)，其次是扁圓形(23.77%)和方(梯)形(20.18%)，心形(0.90%)和長橢圓形(0.90%)最少，出現了倒心形、闊紡錘形、“蘋果型”3種其他類型(8.52%)。堅果橫切面形狀大多為扁圓形(84.30)，未發現有內凹扁圓形和橢圓形，但出現了1種其他類型(長方形，0.45%)。頂尖突出程度以尖最多(58.30%)，果肩形狀以平為主(37.67%)，果底形狀以稍凸為主(43.05%)，核殼表面多為刻窩少(42.60%)、刻紋淺(59.64%)的類型?？p合線以2條居多，占比達89.24%，2～3條和2～4條的資源分別占比6.73%和3.59%,3條的僅出現1份資源，占0.45%，未出現3～4條和4條的資源?？p合線絕大多數為凸起(90.58%)，縫合線平的有9.42%，未見縫合線凹的資源。橫膈膜質地和內褶壁質地均以革質占多數，分別為65.47%和52.91%。橫膈膜骨質占比為23.77%,內褶壁骨質占比26.01%，說明湘西地區存在較多核桃的原始類型。橫膈膜膜質和紙質的占比合計10.77%，內褶壁退化的為21.08%，未見內褶壁膜質資源。核仁皮色多為淺褐(39.46%)，其次為黃(26.46%)、淺黃(13.90%)、褐(13.45%)、黃白(5.83%)、紫褐(0.45%)、淺藍(0.45%)。

表3 核桃表型質量性狀頻率分布及多樣性指數Table 3 The distributive frequency and diversity index for phenotypic quality traits of walnut

2.1.2 數量性狀的變異及分布

堅果表型數量性狀的變異情況見表4。由表4可見，以單果質量的變異系數最大，為27.49%；其次為殼厚，變異系數為26.48%；果形性狀的變異系數較小，變異范圍在8.37%～11.17%。單果質量為5.28～31.70 g，平均13.07 g；殼厚為0.56～2.91 mm，平均1.51 mm；出仁率為29.60%～67.32%，平均37.32%；三徑均值為23.58～40.97 mm，平均30.98 mm；果形指數為0.74～1.25，平均0.97。各個堅果表型數量性狀分布直方圖及其偏度系數(Skewness)和峰度系數(Kurtosis)見圖2，表明8個數量性狀均符合近似正態分布。單果質量以10～14 g居多，占比為49.33%；出仁率多在46%～55%之間，占比為48.88%；殼厚1.0～1.6 mm的比例達到56.95%，說明湘西地區薄殼核桃占比較大，1.6 mm以上的中厚殼資源占比34.98%，1 mm以下的紙皮核桃占比較少，為8.07%；三徑均值集中在30～34 mm，占比達50.22%；果形指數0.97～1.07的占比42.15%。

表4 核桃表型數量性狀的變異情況Table 4 The variations of phenotypic quantitative traits of walnut

圖1 核桃表型數量性狀分布Fig.1 The distribution of phenotypic quantitative traits for walnut

2.2 堅果表型的變異和分化情況

21個供試堅果表型性狀在15個群體間的平均變異系數為7.47%～78.24%，平均為26.47%，各個表型性狀的變異系數間有顯著性差異(P<0.05)(表5)，其中變異程度最大的為種形，變異系數為78.27%，說明此性狀變異最豐富。變異程度較小的為堅果大小和果形相關性狀，變異系數范圍為7.47%～10.39%。群體內21個性狀變異系數的平均值為20.31%～31.54%，群體間差異不顯著(P>0.05)。

表5(續)

對核桃堅果表型性狀的方差分量進行進一步分析表明(表6)：21個堅果表型性狀在群體間和群體內平均方差分量百分比為64.03%和35.97%，說明湘西地區核桃群體間變異大于群體內的變異。其中，果底形狀、刻紋、縫合線突出程度、橫膈膜質地、內褶壁等5個質量性狀的群體間方差分量顯著大于群體內方差分量。數量性狀除側徑外，其他性狀的群體間方差分量均顯著大于群體內方差分量。堅果性狀的表型分化系數為40.44%～76.15%，平均為64.03%，表型分化系數最大的是縱徑，最小的是種形。

表6 核桃堅果表型性狀的方差分量和表型分化系數Table 6 The variance component and phenotype differentiation coefficient of nut phenotypic traits of walnut

2.3 堅果表型性狀聚類分析

表型性狀數據經Z-得分轉化后，采用組間連接歐氏距離法，對223份核桃種質資源的21個堅果表型性狀平均值進行系統聚類分析，結果顯示，在歐氏距離15處，可以將15個群體劃分為4個類群(圖2)。

圖2 核桃表型性狀聚類樹狀圖Fig.2 Cluster tree diagram based on phenotypic traits of walnut

龍山縣各個鄉鎮和瀘溪縣白羊溪(BYX)資源聚為一大類，渠陽(QY)、新關(XG)以及壺瓶山(HPS)均單獨為一類。其中，第1大類資源在歐氏距離10處進一步分為4個亞類，農車(NC)、洛塔(LT)、召市(ZS)、靛房(DF)、洗車(XC)、茨巖(CY)、茅坪(MP)聚為一類，包含154份樣品，來源于龍山縣中東大部分地區，占采集樣品的69.06%；石牌(SP)、洗洛(XL)聚為一類，包括22份樣品，來源于龍山縣西北地區；紅巖溪(HYX)聚為一類，含5個樣品，來源于龍山縣中部；咱果(ZG)和BYX聚為一類，含14樣品，來源于龍山縣西南部及瀘溪縣白羊溪鄉，且表型遺傳距離(歐氏距離)與地理距離呈現正相關的趨勢(圖3)。

圖3 群體間歐氏距離與地理距離的相關關系Fig.3 Geographic distance and Euclidean distance relationship

2.4 堅果表型遺傳距離與地理距離的相關性分析

種群的地理距離和遺傳距離相關性常用Mantel檢驗評估，當P<0.05時，認為地理距離和遺傳距離具有顯著相關性[18]。用SPSS相關性分析計算出群體間的歐氏距離，群體間地理距離為采樣點間的直線距離。Mantel檢驗結果(圖3)表明，群體間的歐氏距離與地理距離存在顯著正相關性(R=0.502，P=0.023)。

3 討 論

表型多樣性是了解遺傳變異的重要線索，也是生物多樣性的重要內容[19]，植物資源的開發利用往往離不開對表型性狀的測定和分析[20-23]。本研究首次對湘西地區的223份核桃資源的21個堅果表型性狀開展研究，結果表明該區域核桃堅果表型多樣性豐富，其堅果質量性狀的變異系數為18.71%～79.21%，Simpson指數為0.171～0.823，Shannon-Wiener指數為0.450～2.760，數量性狀的變異系數8.37%～27.49%。除內凹扁圓形與橢圓形的堅果橫切面形狀，3～4條與4條的縫合線條數、凹縫合線以及膜質內褶壁，核桃屬DUS測試指南中絕大多數堅果表型性狀均有出現。此外，還發現了3種種形、3種沿縫合線縱切面形狀、1種橫切面形狀和1種新的核仁皮色。

湘西地區核桃堅果表型特異性明顯。核桃種形以圓形、扁圓形以及方(梯)形為主，和昭通市[4]、大理州[24]、怒江州[25]、涼山州[5]以及青海[26]等地相比，主要種形和比例均不相同，且方(梯)形占比達20.18%，遠多于上述區域的1.00%～13.94%。橫膈膜骨質和內褶壁骨質占比均超過20%，遠高于其他區域的2.55%～11.21%和 3.18%～14.29%[4-5,24-25,27]；1.6 mm以上的中厚殼資源占比34.98%，說明湘西地區厚殼核桃占比較大，剝殼取仁較難，存在較多核桃的原始類型。核仁皮色多為淺褐或黃色，占65.92%，特異性核仁皮色比例很低，僅出現淺藍色和紫褐色資源各一份，未見烏仁、紫(淺紫)仁資源。核桃縫合線條數特征和其他地區大同小異，大多數為2條，2條以上的資源不多見?？p合線平的資源在該地區比較少見，不到10%，稍高于大理州、怒江州的4%左右[24-25]，與昭通市的14.10%[4]比較接近，低于涼山州的26.97%[5]，遠低于甘肅的40.95%[27]和新疆的55.20%[28]。從這點看，該地區核桃表型介于西南地區的深紋核桃和西北地區的核桃之間,而且更傾向于深紋核桃。另據文獻報道，我國16個早實核桃品種的單果質量為9.40～16.40 g[29]，大巴山區的為4.11～22.87 g[2]，西藏的為6.87～19.97 g[30]，云南的為3.48～31.80 g[4,24-25]，四川涼山州的為3.29～27.56 g[5]，伊朗的為 6.0～15.2 g[31]，印度的為4.85～20.55 g[32-33]，巴爾干半島西部的為2.9～32.1 g[34]。湘西地區單果質量為5.28～31.70 g，和上述區域相比，變異范圍非常大，其中中果型占比近50%，小于7 g的小果資源和大于22 g的大果資源各有4份。這些特異性的種質資源，為品種選育和生產需求提供了豐富的材料。

劉娟等[35]認為，變異系數在10%以上，表型性狀變異分化比較明顯。本區域堅果表型性狀變異系數大都在10%以上，說明該地區表型性狀的分化明顯。表型分化系數平均為64.03%，群體間的表型分化大于群體內的表型分化，說明變異主要來源于群體間?？赡苁窃搮^域核桃長期在一定范圍內種植，商品化程度較低，人為傳播較少，從而造成了群體間的分化。聚類結果顯示龍山縣各個鄉鎮和BYX聚為一大類，QY、XG以及HPS均單獨聚為一類。壺瓶山是湘鄂兩省分界山，地理環境和自然環境和新關鎮有著很大區別，故而雖同處一縣，但HPS和XG各自單獨聚為一類，其遺傳距離與其他群體最遠。第一大類資源又可進一步分為4個亞類：龍山縣中東大部分地區、中部的HYX、西北部的SP與XL、西南部ZG與瀘溪縣BYX，群體間的歐式距離與地理距離存在顯著正相關性。由于表型易受環境的影響，加上本研究采樣未能涵蓋湘西大多數區域，考察的表型性狀有限，僅反映出湘西地區核桃資源多樣性的一部分內容。今后可繼續采集資源，補充完善，以更加系統、全面地反映區域內核桃資源多樣性，為核桃資源的有效開發利用提供更多詳實的數據參考。