咳露口服液指紋圖譜的建立及6種成分的含量測定

賀敬霞,許 剛,黨艷妮,王曉梅,張 鑫,王 青,劉 峰*

1.陜西國際商貿學院, 咸陽 712042;2.陜西步長制藥有限公司, 西安 710075

咳露口服液是由陜西步長制藥有限公司研制的中藥大品種復方制劑,由黃芩、川貝母、枇杷葉、紫菀、甘草等8種中藥制成,具有化痰、止咳、平喘等功效,臨床效果良好,可用于治療支氣管肺炎、細菌性肺炎等引起的咳嗽、咳痰等[1-3]。其不良反應小,安全性高,有效治愈率達98%[4]。既可發揮中樞神經性止咳作用,又可發揮外周神經性止咳作用。雙管齊下,雙效止咳。同時其含有多種成分,可作用于咳嗽反射各個環節,多管齊下,多點作用,使止咳排痰作用更加全面[5]?？嚷犊诜鹤鳛橹兴帍头?藥效物質基礎研究是中醫藥現代化研究的關鍵領域,是決定中藥安全性、有效性和質量控制的基礎。但中藥復方的復雜性和多樣性是中藥現代化研究的難點。鑒于此,關于化學組分,研究者提出多種中藥復方物質基礎研究理論,如“組分結構”理論、“基于成分敲除/敲入的中藥藥效物質辨識與質量控制模式”的研究理論、“等效成分群”理論[6-7]。這些理論的建立都需要進行基礎組分研究。同時指紋圖譜的建立是中藥藥效物質基礎研究中質量控制的重要方法之一。指紋圖譜結合多成分定量分析的中藥質量控制新模式,解決了從整體上全面控制中藥質量的方法學問題。故進行咳露口服液基本物質基礎研究,并建立指紋圖譜方法,確保藥物安全有效,質量可控。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-class超高效液相色譜儀(美國Waters公司);KUDOU超聲儀(上?？茖С晝x器有限公司);MS430TS電子天平和XPE205電子天平均購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Merck Milli-Q純水儀(默克化工技術上海有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、乙腈[GR,塞默飛世爾科技(中國)有限公司];甲醇(AR,國家化學集團化學試劑有限公司)、磷酸(AR,天津市河東區紅巖試劑廠)。

漢黃芩苷(批號MUST-20111601,質量分數≥99.06%),甘草酸銨(批號MUST-21061007,質量分數≥99.06%),異甘草苷(批號MUST-21051501,質量分數≥99.31%),均購自成都曼斯特生物科技有限公司;芹糖異甘草苷(批號PS012516,質量分數≥98.5%,成都普思生物科技有限公司);黃芩苷(批號110715-201720,質量分數≥93.5%),黃芩素(批號1115-201720,質量分數≥98.5%),均購自中國食品藥品檢定研究院;咳露口服液(規格:180 mL·瓶-1,陜西步長制藥有限公司)。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相為乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)。梯度洗脫條件為0～5 min,2%～5%A;5～10 min,5%～10%A;10～15 min,10%～13%A;15～20 min,13%～20%A;20～35 min,20%～30%A;35～45 min,30%～40%A;45～50 min,40%～20%A;50～55 min,20%～2%A。柱溫為常溫;流速為0.2 mL·min-1;進樣量為1 μL;檢測波長為354、250 nm。

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱定芹糖異甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨對照品適量,加甲醇稀釋并定容至刻度,超聲助溶。配制質量濃度分別為311 、369.433、1 122、541.858、780.120、886.587 μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 取咳露口服液1 mL,置于5、50 mL量瓶中,加水稀釋并定容至刻度,搖勻,過0.22 μm濾膜,取續濾液,備用。

2.1.4方法學驗證

2.1.4.1精密度考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項下色譜條件連續進樣6次,以13號峰(黃芩苷)為參照,測得共有峰保留時間RSD值為0.02%,共有峰相對峰面積的RSD值為0.67%～1.35%。表明儀器精密度良好。

2.1.4.2穩定性考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項下色譜條件于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣,以13號峰(黃芩苷)為參照,測得共有峰保留時間RSD值為0.19%～0.26%,共有峰相對峰面積的RSD值為0.27%～2.27%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.4.3重復性考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液,按照2.1.1項下色譜條件進樣,以13號峰(黃芩苷)為參照,測得共有峰保留時間RSD值為0.13%～0.4%,共有峰相對峰面積的RSD值為1.07%～2.20%。表明方法重復性良好。

2.1.5不同批次指紋圖譜考察 按照2.1.3項下方法制備10批次樣品稀釋溶液,按照2.1.1項下色譜條件進樣分析。導入“2012版中藥指紋圖譜相似度評價系統”,以S1為參照圖譜,用平均數時間窗寬度為0.1 min生成對照指紋圖譜,進行不同批次色譜圖進行自動匹配。結果詳見圖1、圖2。由圖1可知,在250 nm處指認出25個色譜峰。其中13號峰為黃芩苷、19號峰為漢黃芩苷、21號峰為黃芩素、23號峰為甘草酸銨。由圖2可知,在354 nm處指認出19個色譜峰。11號峰為芹糖異甘草苷、12號峰為異甘草苷、13號峰為黃芩苷、17號峰為漢黃芩苷、19號峰為甘草酸銨。樣品相似度結果見表1。由表1可知,以S1為參照色譜,在354 nm處各批次樣品間的相似度為0.991～1.000,同時在250 nm處各批次樣品相似度為0.990～1.000,均符合指紋圖譜質量控制規定[8]。表明咳露口服液質量穩定,建立的UPLC法適用于咳露口服液的質量評價與控制。

注:13.黃芩苷;19.漢黃芩苷;21.黃芩素;23.甘草酸銨。

注:11.芹糖異苷草苷;12.異甘草苷;13.黃芩苷;17.漢黃芩苷;19.甘草酸銨。

2.2 含量測定

色譜條件同2.1.1項下條件,檢測波長。芹糖異甘草苷、異甘草苷為354 nm,黃芩苷、漢黃芩苷、甘草素、甘草酸銨為250 nm。色譜圖見圖3。

注:1.芹糖異甘草苷;2.異甘草苷;3.黃芩苷;4.漢黃芩苷;5.黃芩素;6.甘草酸銨。

2.2.1方法學驗證

2.2.1.1標準曲線的制備 分別精密吸取各對照品溶液適量,置于量瓶中,加甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,得系列線性對照品溶液,按照2.1.1項下色譜條件進樣,以峰面積y為縱坐標、質量濃度x(μg·mL-1)為橫坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程,結果見表2。

表2 6種指標成分的標準曲線及線性范圍

2.2.1.2精密度考察 精密吸取各對照品適量,混合,按照2.1.1項下色譜條件,連續進樣6次,計算芹糖異甘草苷、黃芩苷、異甘草苷、漢黃芩苷、甘草酸銨、黃芩素6種成分峰面積的RSD值分別為0.90%、0.73%、1.25%、0.67%、1.35%、1.10%。表明儀器精密度良好。

2.2.1.3穩定性考察 取咳露口服液(批號210226),按照2.1.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項下色譜條件,分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣,測定芹糖異甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨峰面積,計算得樣品溶液RSD值分別為0.54%、1.31%、0.63%、0.71%、2.64%、1.52%,均小于3%,表明樣品溶液24 h內穩定性較好。

2.2.1.4重復性考察 稱取同一批次(批號210226)咳露口服液,按照2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液,按照2.1.1項下色譜條件測定,依次測得6種成分峰面積,得RSD值分別為2.06%、2.48%、2.33%、2.56%、2.40%、2.29%,均小于3%,該方法重復性良好。

2.2.1.5加樣回收率考察 取同一批已知含量的咳露口服液(批號210226)2.5 mL 6份,分別精密加入各對照品溶液,按照2.1.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項下色譜條件測定,計算加樣回收率,測得各對照品的平均加樣回收率范圍為98%～103%,其RSD(n=6)<3%,詳見表3,說明該方法準確度良好。

表3 對照品加樣回收率實驗結果

2.2.2不同批次咳露口服液含量測定 按照2.1.3項下方法制備10批次樣品溶液,按照2.1.1項下色譜條件進樣分析,并測定咳露口服液中6種成分含量。見表4。由表4可知,10批次咳露口服液各成分含量范圍為芹糖異甘草苷25.057～29.65 μg·mL-1,異甘草苷26.404～32.072 μg·mL-1,黃芩苷824.457～1 291.929 μg·mL-1,漢黃芩苷319.541～557.251 μg·mL-1,黃芩素4.243～15.839 μg·mL-1,甘草酸銨250.566～479.037 μg·mL- 1。

表4 10批咳露口服液的含量測定結果

3 討論

3.1 色譜條件篩選

本實驗分別對甲酸水、磷酸水及不同pH磷酸氫二鉀流動相溶液進行篩選,甲酸水對比磷酸水,在相同條件下,色譜峰較磷酸水少,且峰形、分離度差。用磷酸氫二鉀溶液,隨著pH值的增大色譜峰分離較好,pH雖在C18色譜柱酸堿范圍內,但柱效發生較大變化,且大大降低了色譜柱的使用壽命,通過對比最終選用磷酸水進行咳露口服液的分離研究。通過UPLC全波長掃描,各有效色譜峰在230、280、250、354 nm等波長處部分峰的靈敏度及吸收較好,為使該色譜方法更有效地進行指認峰的測定,綜合考慮選用250、354 nm進行波長檢測。同時在26 min前色譜圖峰形較多,而目前咳露口服液已確定已知成分較少,后期可進一步進行咳露口服液的物質基礎研究。

3.2 樣品處理及含量測定

前期對咳露口服液進行24、48、72 h,體積分數為20%～80%乙醇的醇沉溶液考察,結果顯示不同體積分數乙醇及醇沉時間對色譜峰的數量、含量及色譜柱柱效等未產生較大的變化,表明咳露口服液中含有的糖分較少,對色譜柱及有效成分結果影響較小[9]。同時通過10批次樣品溶液的含量測定,在咳露口服液中,其成分含量最高為漢黃芩苷,其次為黃芩苷、甘草酸銨。本研究結果表明建立的指紋圖譜方法穩定,建立的色譜方法可用于已指認出的成分含量測定。2種方法的結合可共同用于咳露口服液的質量控制。