苓桂術甘湯與腎氣丸“同病異治”慢性心力衰竭的機制

梁景乾,蔡晶茹,懷寶賡,劉德山

1.山東中醫藥大學,濟南 250014;2.山東大學齊魯醫院,濟南 250012

慢性心力衰竭(Chronic heart failure, CHF)是心血管疾病的終末期表現,主要表現為呼吸困難、疲乏與液體潴留等,根據臨床特征本病可歸屬于中醫“心脹”、“心水”等范疇?！督饏T要略·痰飲咳嗽病脈證并治》載:“夫短氣有微飲,當從小便去之,苓桂術甘湯主之,腎氣丸亦主之”,提出了2首利水的經典名方。臨床試驗研究表明,苓桂術甘湯與腎氣丸有改善心室重構、保護心肌細胞和調節神經體液因子水平等功效[1-2]。

本研究用網絡藥理學發掘苓桂術甘湯和腎氣丸的有效活性成分以及作用靶點并研究其與慢性心力衰竭的相關性,對其潛在的作用機制進行梳理比較,為慢性心力衰竭的治療探尋新的方向與思路。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分與靶點的預測

苓桂術甘湯由茯苓、桂枝、白術及甘草4味藥組成,腎氣丸由生地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝與附子8味藥材組成。用中藥化學數據庫Batman-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)[3]收集苓桂術甘湯和腎氣丸的主要化學成分,并用Batman分析平臺獲得苓桂術甘湯與腎氣丸潛在的作用靶點,篩選其中有較高可信度(Prediction Score cutoff≥20)的靶點。

1.2 慢性心力衰竭疾病靶點的收集與標準化

以“chronic heart failure”為關鍵詞在TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[4]與Drugbank(https://go.drugbank.com/)[5]數據庫檢索相關藥物對應的疾病靶點;于OMIM(https://www.omim.org/)[6]數據庫中篩選前200個相關靶點,并于GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)[7]中篩選出相關度較高的靶點(Relevance score≥20),刪除重合基因條目后獲得CHF的疾病靶點。再用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)[8]將檢索得到的藥物靶點和疾病靶點標準化為智人源基因。

1.3 中藥-化合物-疾病靶點網絡的構建

將苓桂術甘湯與腎氣丸的藥物靶點與CHF的疾病靶點取交集,繪制Venn圖,分析苓桂術甘湯及腎氣丸治療CHF的共同靶點及特有靶點。用Cytoscape3.7.2軟件構建苓桂術甘湯與腎氣丸治療CHF的“中藥-化合物-疾病靶點”網絡。

1.4 蛋白相互作用(PPI)網絡構建與拓撲分析

用String數據庫(https://string-db.org/)[9]導入藥物-疾病的交集靶點構建PPI網絡,用Cytoscape軟件中的工具Network Analyzer對上述PPI網絡進行拓撲分析,用度(Degree)、介數(Betweenness Centrality)、聚集系數(Closeness Centrality)等網絡拓撲參數分析苓桂術甘湯與腎氣丸的核心相互作用靶點[10]。

1.5 生物功能及通路富集的分析

用Metascape數據庫(https://metascape.org/)[11],分別將兩方核心相互作用靶點導入數據庫,通過基因注釋及蛋白相互作用等方式進行GO分析、 KEGG通路以及Reactome通路分析。設定P<0.01、最小計數為3、富集因子>1.5,并根據Kappa得分將功能進行聚類,將相似度>0.3的子功能進行聚類,按照adjustP值大小排序所篩前10的條目,分析結果并可視化。此外運用MCODE算法對蛋白相互作用網絡進行模塊分組,并對相應的模塊進行功能描述,選取adjustP值前3的條目進行可視化。

1.6 調控靶點預測以及分子對接驗證

根據富集分析結果推測藥物的調控靶點及通路并繪制靶點-通路示意圖。從RCSBPDB數據庫(http://www.rcsb.org/)[12]獲取靶點受體的晶體結構文件,從Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]獲取藥物活性成分的結構文件,用Autodock_vina[14]軟件評估兩者間的結合能力,并用網頁工具PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/)[15]以及PoseView[16]將結果可視化。

2 結果與分析

2.1 中藥-化合物-疾病靶點網絡的構建

通過Batman-TCM篩選出高可信度的靶點,苓桂術甘湯的活性成分與靶點分別為112、1 164個,腎氣丸的活性成分與靶點分別為141、1 280個。與CHF有關的疾病靶點為1 187個。三者取交集結果顯示苓桂術甘湯有273個治療靶點,其中特有靶點23個;腎氣丸有298個治療靶點數,其中特有靶點48個。兩方共同的作用靶點有250個。見圖1。用Cytoscape 3.7.2構建苓桂術甘湯及腎氣丸的活性成分與CHF疾病靶點的網絡圖,見圖2。ESR1、AR、NR3C1和NR3C2等靶點連接的成分較多,說明作用靶點可能與類固醇受體相關。

注:紅色為苓桂術甘湯的靶點數;藍色為腎氣丸的靶點數;綠色為慢性心力衰竭的靶點數。

注:綠色為共有的成分與治療靶點;紅色為苓桂術甘湯特有的成分與治療靶點;藍色為腎氣丸特有的成分與治療靶點。

2.2 PPI網絡構建及拓撲分析

將映射得到的273個苓桂術甘湯治療靶點與298個腎氣丸治療靶點分別上傳到String數據庫,構建PPI網絡,見圖3(A、C),圖中節點表示蛋白,邊表示功能相關性。苓桂術甘湯共涉及273個節點,4 834條邊,腎氣丸共涉及297個節點,5 192條邊。用Cytoscape3.72軟件拓撲分析,苓桂術甘湯PPI度值中位數為28,以“Degree≥56”(大于等于2倍的中位數值)為標準篩選51個候選靶點;對候選靶點的參數信息進一步提取,以度、介數、聚集系數的中位數為條件,最終得到苓桂術甘湯的核心靶點23個,其中特有的作用靶點有3個,為AKT1、MMP9、NOS3;用相同的方法得到腎氣丸的核心靶點22個,特有的作用靶點有3個,為ALB、MAPK1、PTEN。見圖3(B、D)。兩方共同作用于SRC、TP53、EGFR、INS、IGF1、IL1B、IL6、TLR4及TNF等與細胞增殖、血管生成及炎癥反應相關的靶點。

注:圖形大小以及顏色表示蛋白的重要程度;紅色為方劑特有的核心作用蛋白。

2.3 苓桂術甘湯功能富集分析

將苓桂術甘湯23個核心靶點導入Metascape數據庫,從分子功能(Molecular Function)、細胞組分(Cellular Component)和生物進程(Biological Process)等方面對靶點進行GO分析;并借助KEGG與Reactome數據庫的基因集對靶點進行通路分析。并用MCODE算法對其蛋白相互作用進行功能分析。

結果顯示苓桂術甘湯靶點富集在一氧化氮合酶調節因子活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、胰島素受體結合(insulin receptor binding)和血紅素結合(heme binding)等分子上,作用于內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)、膜筏(membrane raft)等細胞組分,影響肌細胞增殖(muscle cell proliferation)、調控氧化應激反應(response to oxidative stress)等生物進程,如圖4A所示。KEGG通路主要富集在腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)以及缺氧誘導因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等;reactome通路主要富集在核外雌激素信號(extra-nuclear estrogen signaling)、白細胞介素-4和白細胞介素-13信號轉導(interleukin-4 and interleukin-13 signaling)等,如圖4B所示。核心蛋白相互作用模塊分析結果表明,苓桂術甘湯可能參與調控生長因子信號介導的生物進程,與內皮細胞增殖、遷移以及血管生成有關。還可能參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3K/Akt signaling pathway)的調控,如圖5所示。綜合上述富集分析結果可知,苓桂術甘湯與內皮一氧化氮合酶(eNOS)的激活有關,其機制可能是通過調控Akt磷酸化實現的。

注:圖A橫坐標為富集在該條目基因占導入總基因的比率;圖形的大小為富集基因的數量;顏色為adjust P值的大小;圖形形狀為GO分析的分類。圖B橫坐標為adjust P值的大小;右側為通路的功能分類;紅色為KEGG通路;藍色為reactome通路。

注:圖A中紅色蛋白為模塊1、藍色蛋白為模塊2。圖B橫坐標為富集在該條目蛋白與模塊蛋白的比率;圖形大小為富集蛋白的數量;顏色為adjust P值的大小;色塊為富集功能的類別以及蛋白的組別。

2.4 腎氣丸功能富集分析

用相同的方法對腎氣丸22個核心靶點進行功能富集分析,結果顯示腎氣丸主要功能富集在生長因子受體結合(growth factor receptor binding)、胰島素受體結合等分子上,作用于內質網腔、膜筏等組分,影響肌細胞增殖、絲裂原活化蛋白激酶級聯的調控(regulation of MAPK cascade)、調控生長因子的反應(response to growth factor)和細胞死亡的正調控(positive regulation of cell death)等生物進程。如圖6所示。

圖6 腎氣丸GO功能氣泡圖

KEGG通路涉及TNF信號通路與叉頭框蛋白O信號通路(FoxO signaling pathway);reactome通路涉及磷脂酰肌醇(3,4,5)-磷酸激活蛋白激酶B信號(PIP3 activates AKT signaling)、磷酸酶與張力蛋白同源物調控(PTEN regulation)等。如圖7所示。

圖7 腎氣丸通路分類點線圖

核心蛋白相互作用模塊分析結果表明,腎氣丸仍與流體剪切應力、動脈粥樣硬化、PI3K/Akt信號通路等途徑有關。見圖8、圖9。綜合上述結果可知腎氣丸與MAPK級聯的調控關系密切,可能參與調控細胞外調節蛋白激酶(ERK)通路,且可能通過PTEN負調控PI3K/Akt信號通路。

圖8 腎氣丸模塊分析網絡

圖9 腎氣丸模塊功能富集桑葚氣泡圖

2.5 靶點預測以及分子對接驗證

根據富集分析結果推測兩方治療慢性心力衰竭涉及ERK、PI3K途徑,可能與雌激素受體以及生長因子受體的激活有關,兩方治療CHF的靶點通路示意圖見圖10。

圖10 藥物靶點-通路示意圖

苓桂術甘湯通過調控AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)介導PI3K/Akt/eNOS及NFκB通路發揮降壓、抗凋亡的作用,通過抑制MAPK通路發揮抗炎抗凋亡的作用,可能與保護內皮細胞與心肌細胞等功能相關。腎氣丸通過調控絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)抑制ERK通路以及通過PTEN負調控PI3K/Akt促進細胞凋亡,這可能與抗心臟病理性增生以及纖維化的功能有關。將上述推論用分子對接進行虛擬驗證。

從RCSBPDB數據庫獲取AKT1的晶體結構(4EKL)以及MAPK1的晶體結構(6SLG),根據圖2中成分與靶點的對應關系,結合文獻挑選出有文獻報道的成分,AKT1對應成分為甘草素(Liquiritigenin)[17],MAPK1對應成分為棍掌堿(Coryneine)[18],從Pubchem數據庫獲取小分子結構并用Autodock_vina進行分子對接驗證。一般認為進行分子對接時結合能的絕對值越大,化合物與靶點親和力越強,構象越穩定;絕對值大于5.0表示具有較好的結合活性,大于7.0表示具有強烈的結合活性[19]。結果表明,甘草素與棍掌堿均與靶點有良好的結合活性,兩者的結合能以及結合模式見圖11。

注:A.Liquiritigenin-AKT1結合平面圖;B.Coryneine-MAPK1結合平面圖;C.Liquiritigenin-AKT1結合3D圖;D.Coryneine-MAPK1結合3D圖;虛線表示氫鍵;綠色線條表示疏水相互作用;藍色線條表示氫鍵;黃色虛線表示疏水相互作用;數字表示原子間距離。

因為缺乏有效的文獻報道,從RCSBPDB數據庫獲取PTEN的晶體結構(1D5R)與圖2中γ氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)進行分子對接,結果得到最小結合能為-4 kcal·mol-1,表明兩者結合活性不強。

3 討論

“夫短氣有微飲,當從小便去之”傳統醫學解釋為水飲內阻,陽氣不化,其本在脾腎。水飲停留,妨礙氣機升降,所以短氣陽氣不化,必見小便不利。治以溫陽化氣,當從小便去之,即利水通陽之意。中陽不運,水行為飲者,其本在脾,下焦陽虛,不能化水者,其本在腎。前者有苓桂術甘湯健脾利水,后者用腎氣丸溫腎化氣。

本研究用網絡藥理學方法比較兩首方劑治療CHF的機制差異,構建中藥-化合物-靶點網絡,結合PPI網絡以及富集結果分析,推斷定位在膜筏上的核外類固醇受體為兩方的主要靶點,尤以雌激素受體ERα(ESR1)最為關鍵。其通過產生cAMP、cGMP和鈣通量等快速信號以及反式激活生長因子受體等方式啟動MEK-ERK和PI3K-AKT激酶級聯反應,參與血管內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖、遷移[20]。其他受體如糖皮質激素在血管系統中的作用與雌激素類似,會迅速激活PI3K和Akt,提高一氧化氮合酶活性;鹽皮質激素受體(NR3C2)在心血管中與壓力反射敏感性的減退有關,還能調節腎臟中鈉的重吸收和鉀的排泄,調節水鹽平衡;雄激素受體(AR)在CHF代償及調節神經內分泌等方面發揮重要作用[21-23]。

兩方的保護機制差異,推測主要體現在對MEK-ERK和PI3K-AKT激酶級聯反應的調控上。AKT1可能為苓桂術甘湯主要的調控分子,可能通過PI3K/Akt/eNOS途徑介導血管修復作用。內皮細胞的膜ERα在接收雌激素信號后,能使eNOS3快速激活以及產生一氧化氮(NO),調節動脈再內皮化和血管舒張,發揮保護血管結構、增強內皮血管功能和降低血壓等作用[24]。此外,DOU J[25]等發現調節PI3K/Akt/eNOS能改善載脂蛋白e缺陷小鼠的脂質代謝、糖耐量和胰島素敏感性,具有抗動脈粥樣硬化作用。

分子對接結果顯示甘草素與AKT1具有較好的結合能力,甘草素是甘草中一種含量較多的二氫黃酮類化合物,具有良好的細胞保護作用。藥理研究表明,二氫黃酮類化合物有抑制氧化應激反應和調節NO等功能[26],說明甘草素可能通過PI3K/Akt/eNOS介導細胞保護,甘草素有雌激素受體β的選擇性激動劑的作用,研究表明膜ERβ受體(ESR2)的信號傳遞對心臟內穩態、防止心臟肥大和纖維化非常重要。

然而過表達的Akt可誘導纖維化,其介導mTOR通路影響促纖維因子的表達,促進生成NO,影響心臟成纖維細胞的膠原沉積和活性,且影響心臟的收縮功能,從而調節心臟纖維化的進展[27]。由腎氣丸的功能富集分析結果可知,腎氣丸存在調控PTEN、負調節PI3K/Akt途徑的可能,研究表明PTEN可以通過負調節Akt發揮抗纖維化的作用,也是抑制心臟肥大和纖維化的直接靶點[28-29]。分子對接結果顯示GABA與PTEN沒有良好的結合性能,但有報道表明GABA受體通過調節小鼠巨噬細胞影響壓力超負荷誘發的心力衰竭,而PTEN可使GABA受體去磷酸化,PTEN在生理狀態下表達微量,推測GABA可能存在反饋機制,可調節PTEN的表達,為治療心力衰竭的研究提供了新的思路[30-31]。棍掌堿與MAPK1有良好的結合活性,棍掌堿是一種多巴胺的季銨鹽衍生物,具有弱強心作用,多巴胺治療心力衰竭作用具有多樣性以及劑量依賴性,低劑量時可擴張血管、增加心輸出量、腎血流量以及尿鈉排出量,臨床研究表明持續低劑量的泵入多巴胺對治療頑固性心力衰竭有效[32],推測其機制可能是通過抑制MAPK1的表達阻斷醛固酮對鈉的重吸收。最近的研究表明,多巴胺受體激動劑能抑制成纖維細胞的分化與增殖,抑制RAS/ERK通路,具有抗心肌纖維化的作用,為治療心臟纖維化提供了新的研究方向[33-34]。

PPI以及通路富集分析表明,兩方具有良好的抗炎抗氧化的能力,茯苓酸是茯苓及腎氣丸中的主要指標成分[35-36]?，F代藥理研究表明,茯苓酸等茯苓四環三萜類化合物的化學結構與醛固酮受體拮抗劑結構類似,可發揮抗纖維化以及利尿等作用,其還可通過恢復堿性磷酸酶(ALP)活力,下調NO、TNF-α、IL-1β生成,減少NF-κB配體受體激活劑、COX-2、MMP-2、MMP-9,移除活性氧簇(ROS),減輕炎癥以及氧化應激狀態的不利影響[37-38]。

綜上所述,苓桂術甘湯與腎氣丸均有利尿、降壓、擴血管、抗炎、抗氧化、改善心肌肥厚與纖維化等作用,苓桂術甘湯可通過介導PI3K/Akt信號通路發揮保護內皮細胞、抗動脈粥樣硬化等作用,以延緩心力衰竭的進程;腎氣丸調控ERK信號通路,使其強心、抗纖維化的作用更突出。另外,運動可以改善心力衰竭患者心功能和逆轉左室重構,IGF1/PI3K/Akt通路是保護作用的關鍵,為運動聯合中藥預防心衰的進展提供了理論依據[39]。PTEN的腎保護功能以及神經遞質等成分也證明腎氣丸能抗腎纖維化、抗抑郁,實現對疾病后期并發癥的治療[40]。本研究用網絡藥理學以及分子對接的方法,從作用機制上闡釋了兩方治療的差異,為慢性心力衰竭的藥理研究以及臨床治療應用提供了新的方向。