HPLC法測定度米芬原料的有關物質

陳 聰,劉玉虎,王 磊

1.安徽醫科大學附屬宿州醫院(安徽省宿州市立醫院)藥劑科, 宿州 234000;2.蚌埠醫學院藥學院,蚌埠 233030

度米芬是一種陽離子表面活性劑型廣譜殺菌劑,具有廣泛的抗菌譜及抗菌活性,對革蘭陽性和陰性菌及真菌均有較好的殺滅作用[1],主要用于創面、黏膜、皮膚[2]、器械的消毒,亦可用于口腔、咽喉感染的輔助治療[3]。度米芬現收載于2020年版《中國藥典》二部[4],為白色至微黃色片狀結晶,化學名為溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十二烷銨一水合物,易溶于乙醇和水,目前市售制劑有度米芬滴丸和度米芬含片,臨床應用較為廣泛。度米芬現行質量標準僅用滴定法對其所含非季銨類物質進行測定,該方法操作復雜,誤差較大,相關的文獻也僅限于對度米芬含量進行檢測[5-7],未檢索到對該制劑有關物質研究的相關報道。該產品及其制劑的用藥安全性存在一定風險[8]。本研究結合度米芬原料藥生產工藝,確定度米芬原料主要雜質為苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨,結構式見圖1。其中苯酚毒性較大,各行各業對其檢測方法也在積極探索中[9-16],主要方法以HPLC[17-19]為主。本文用HPLC法對上述4種雜質進行檢測,建立度米芬有關物質檢測方法,為控制該產品的質量提供數據支持。

圖1 各成分化學結構式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Scientific U3000液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];Mettler Toledo XS205DU電子天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司];PHS-3W型pH計(上海班特儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

對照品:度米芬(批號100455-202002,質量分數99.8%)、苯酚(批號100509-202005,質量分數100.0%)來源于中國食品藥品檢定研究院;N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺(批號13468-02-5,質量分數98.0%)來源于上海畢得醫藥科技股份有限公司;溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨(批號202005907,質量分數98.0%)、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨(批號20200819,質量分數98.0%)由實驗室自制。度米芬原料(批號:20201225、20210317、20210601)來源于重慶青陽藥業有限公司;乙腈為色譜純;其他為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

用Agilent 5TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈為流動相A、0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.01 mol·L-1十二烷基硫酸鈉(磷酸調節pH至3.0)為流動相B,流速為1.0 mL·min-1,進行梯度洗脫;檢測波長為220 nm;進樣量為20 μL;柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1稀釋劑 取乙腈和水各適量,搖勻,制成乙腈-水(50∶50)的溶液作為稀釋劑。

2.2.2對照品儲備液 精密稱取苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨對照品各適量,用稀釋劑溶解并稀釋成每1 mL中含上述成分各0.1 mg的雜質混合對照品儲備液。精密稱取度米芬對照品適量,用稀釋劑溶解并稀釋成5 mg·mL-1的度米芬對照品儲備液。

2.2.3雜質混合對照品溶液 精密吸取2.2.2項下雜質混合對照品儲備液適量,用稀釋劑稀釋成每1 mL中含上述成分各2 μg的雜質混合對照品溶液。

2.2.4系統適用性實驗溶液 精密吸取2.2.2項下度米芬對照品儲備液4.0 mL、雜質混合對照品儲備液0.2 mL置于同一10 mL量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,制成系統適用性實驗溶液。

2.2.5供試品溶液 精密稱取度米芬原料藥適量,用稀釋劑溶解并稀釋成2 mg·mL-1的供試品溶液。

2.2.6自身對照溶液 精密吸取2.2.5項下供試品溶液1.0 mL置于100 mL量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,制成自身對照溶液。

2.3 系統適用性實驗

精密吸取2.2.4項下系統適用性實驗溶液20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,進行系統適用性實驗,記錄色譜圖,見圖1。雜質苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨與度米芬色譜峰以及各雜質間色譜峰分離度均不低于1.5。理論板數按各成分色譜峰計均大于10 000。

2.4 專屬性實驗

取2.2.5項下供試品溶液作為未破壞供試品溶液;精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的鹽酸溶液(1.0 mol·L-1),于80 ℃水浴中加熱30 min,取出,冷卻至室溫,加入1.0 mL的氫氧化鈉溶液(1.0 mol·L-1)中和,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為酸破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的氫氧化鈉溶液(1.0 mol·L-1),于80 ℃水浴中加熱30 min,取出,冷卻至室溫,加入1.0 mL的鹽酸溶液(1.0 mol·L-1)中和,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為堿破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入稀釋劑5.0 mL溶解,于80 ℃水浴中加熱8 h,取出,冷卻至室溫,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為熱破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的過氧化氫溶液(體積分數為3%),于80 ℃水浴中加熱30 min,取出,冷卻至室溫,作為氧化破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入稀釋劑5.0 mL溶解,于4 500±500 lx條件下連續光照7 d,取出,冷卻至室溫,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為光照破壞供試品溶液。

精密吸取上述溶液和空白溶液(稀釋劑)各20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,記錄色譜圖。見圖2。結果空白溶液對供試品溶液的測定無干擾,酸、堿、高溫、氧化和光照等破壞供試品溶液降解雜質峰與度米芬主峰間分離度均大于1.5,主峰純度因子均大于970,物料平衡符合《中國藥典》規定要求。表明所建立的方法專屬性良好。

注:1.苯酚;2.N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺;3.未知雜質;4.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨;5.度米芬;6.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨;7.未知雜質。

注:A.空白溶液;B.未破壞供試品溶液;C.酸破壞供試品溶液;D.堿破壞供試品溶液;E.高溫破壞供試品溶液;F.氧化破壞供試品溶液;G.光照破壞供試品溶液;1.苯酚;2.N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺;3.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨;4.度米芬;5.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨。

2.5 線性范圍考察實驗

取苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨對照品各適量,用稀釋劑溶解并稀釋,制成質量濃度分別為5.22、4.62、4.96、4.34 μg·mL-1的混合溶液,分別精密吸取上述混合溶液0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 mL,置于5個25 mL量瓶中,制成系列線性混合對照品溶液。精密吸取上述5種溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,將峰面積與質量濃度進行線性回歸,結果見表2。

表2 線性關系考察結果

2.6 檢測限和定量限實驗

取2.5項下混合溶液用稀釋劑逐級稀釋,并精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀中檢測,信噪比S/N約為10時的質量濃度作為定量限,信噪比S/N約為3時的質量濃度作為檢測限,計算各成分的檢測限和定量限,結果苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨的檢測限分別為6.13、4.79、5.26、3.94 ng·mL-1,定量限分別為18.19、12.38、15.34、13.81 ng·mL-1。

2.7 加樣回收率實驗

精密吸取2.2.2項下雜質混合對照品儲備液(苯酚0.105 4 mg·mL-1、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺0.098 6 mg·mL-1、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨0.101 8 mg·mL-1、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨0.094 6 mg·mL-1)1 mL,用稀釋劑稀釋至10 mL,制成加樣雜質混合對照品儲備液,備用。精密稱取同一批次已知雜質質量分數[溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨質量分數依次為0.0164%、0.0073%,苯酚和N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺均未檢出]的度米芬原料藥12份,每份20 mg,各置于10 mL量瓶中,隨機分成4組,精密加入上述加樣雜質混合對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6 mL,按2.2.5項下供試品溶液制備方法制備,精密吸取上述溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,計算各成分加樣回收率及RSD值。苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨的平均回收率分別為99.74%、100.08%、99.19%、98.79%,RSD分別為0.56%、1.12%、0.91%、1.42%。

2.8 溶液穩定性實驗

按2.2.5項下方法分別制備供試品溶液,于0、2、5、9、16、24 h依法進樣檢測,結果供試品溶液中度米芬峰面積RSD值分別為0.37%,總雜質無明顯增加;按2.2.3項下方法制備雜質混合對照品溶液,于0、2、5、9、16、24 h依法進樣檢測,結果雜質混合對照品溶液中苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨峰面積RSD值分別為0.11%、0.49%、0.37%、0.24%。表明該溶液在室溫條件下穩定性良好。

2.9 重復性實驗

精密稱取度米芬原料藥20 mg,置于10 mL量瓶中,精密加入2.2.2項下雜質混合對照品儲備液0.2 mL,再按照2.2.5項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液,平行制備6份,各精密吸取上述溶液20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,結果苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨含量的RSD值分別為0.81%、0.97%、1.24%、0.65%,表明方法的重復性良好。

2.10 中間精密度實驗

按照2.9項下溶液制備方法制備供試品溶液,分別考察不同分析實驗員、實驗日期和實驗儀器對精密度的影響。結果在不同分析實驗員條件下苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨RSD值(n=12)分別為2.18%、1.46%、0.98%、1.73%;在不同實驗日期條件下各成分RSD值(n=12)分別為1.57%、0.98%、0.76%、1.41%;在不同儀器條件下各成分RSD值(n=12)分別為1.88%、1.27%、0.81%、2.34%。所得RSD值均小于10%,表明方法的中間精密度良好。

2.11 耐用性實驗

為確保所建立的方法能夠適用于常規檢驗,取2.9項下制備的供試品溶液,分別考察流動相A(±2.0%)、流速(±0.1 mL·min-1)、色譜柱(Agilent 5TC C18、Waters Nova-Pak C18、Dikma Spursil C18)、柱溫(±5 ℃)對雜質苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨檢驗結果的影響,結果待測雜質與相鄰色譜峰均能達到有效分離,方法耐用性良好。

2.12 樣品測定

取度米芬原料藥3批,按2.2項下方法制備供試品溶液,在2.1項色譜條件下進樣檢測,記錄雜質苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨色譜峰面積并計算各雜質成分含量,結果見表3。

表3 3批原料樣品測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本實驗在確定檢測波長時,用DAD檢測器對度米芬對照品溶液及苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨對照品溶液進行了紫外掃描,發現度米芬和各雜質對照品的最大吸收波長均是220 nm,遂用220 nm作為檢測波長運行梯度洗脫程序,可保證檢測雜質含量的準確度。

3.2 柱溫的選擇

在考察色譜條件時,考慮到流動相中緩沖鹽濃度較高,溫度高可降低色譜柱使用壓力,延長色譜柱使用壽命,對柱溫進行了考察,在30、35、40、45、50 ℃條件下進樣度米芬供試品溶液,發現在柱溫為40 ℃時,柱效最好,雜質最少,同時基線最為平穩。最終確定柱溫為40 ℃。

本研究根據分析方法驗證指導原則[20]對度米芬原料中的苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨的含量進行了方法學考察,建立了度米芬原料中有關物質苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨同時測定的HPLC法,該方法靈敏度高,專屬性強,可用于度米芬原料有關物質的質量控制。