微波消融對甲狀腺乳頭狀癌病理學診斷的影響

陳建發，謝明，馮蕊，覃夏，謝奎龍，馮巧智，林子峰，朱文彬（南部戰區海軍第一醫院.普通外科；.病理科，廣東湛江 54009）

微波消融術是近年發展起來的一種微創治療技術，其原理為通過微波產生高溫，使靶組織細胞發生凝固性壞死，臨床上已廣泛應用于小肝癌、肺癌等[1-3]。由于其具有損傷小、恢復快、重復性好、多數不影響美觀且更好地保留了甲狀腺功能、提高了患者生活質量等特點，超聲引導下經皮微波消融術（UPMA）已成為甲狀腺疾病微創治療的研究熱點和趨勢[4-5]。但是，就目前而言，沒有足夠的循證醫學證據證明UPMA 對原發性甲狀腺癌治療的有效性，故不推薦將UPMA 作為甲狀腺癌治療的常規手段。因此，國內外指南均推薦行UPMA 的患者術前需穿刺活檢以獲得滿意的病理結果[6-7]。與超聲引導下細針穿刺細胞學（US-FNA）相比，雖然超聲引導下粗針穿刺組織學（US-CNB）具有相似的特異度和陽性預測值，但其靈敏度、陰性預測值和準確度更高。因此，US-CNB檢查對甲狀腺結節的診斷具有更高價值[8-9]。然而，USCNB 有一個明顯的不足之處在于術中出血風險高，嚴重制約了其臨床開展。能否在甲狀腺結節行微波消融治療后再行術后即刻US-CNB，使其既可以提高穿刺病理檢查的取材滿意率和診斷準確性，又可以減少穿刺過程的出血風險，相關研究鮮有報道。該技術路線可行與否的關鍵點在于微波消融是否會造成甲狀腺癌病理特征的喪失，如乳頭狀結構、毛玻璃樣核、核溝或核包涵體等。本研究通過對比觀察甲狀腺乳頭癌切除標本行微波消融前后的病理特征變化，明確微波消融對甲狀腺乳頭癌組織結構、細胞形態和免疫組化檢查的影響，為甲狀腺結節微波消融術后即刻US-CNB 提供科學依據。

1 資料和方法

1.1 病例

選取2020 年12 月1 日至2021 年12 月1 日南部戰區海軍第一醫院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者。甲狀腺乳頭狀癌由2 名病理科專家依據病理學檢查結果獨立診斷，意見不同時由2 人共同會診再做出最后診斷。診斷標準參照《臨床病理科診斷常規》[10]。納入標準：（1）術前細針穿刺活檢細胞學病理FNABethesda 報告系統報告為V 或Ⅵ類；（2）腫瘤結節長徑≥10 mm。排除標準：（1）重要臟器功能不全；（2）嚴重凝血功能障礙；（3）患者不同意手術；（4）術后病理學診斷為良性病變。共納入26 例，其中男8 例，女18 例，年齡28～72 歲，平均（43.2±5.8）歲。甲狀腺腫瘤結節大小10～31 mm，平均（13.0±6.4）mm。手術方式：甲狀腺患側全切、峽部切除及中央區淋巴結清掃術23例，甲狀腺全切、中央區淋巴結和頸側區淋巴結清掃術3 例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬對研究內容均知曉并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）和細胞角質蛋白19（CK19）多克隆抗體、抗兔二抗購自邁新公司。微波消融儀為南京億高微波消融儀KY-2000 及其匹配的循環水冷卻系統，包括頻率為2 450 MHz 的微波發生器，輸出功率30～55 W。配備KY-2450A-1A 一次性無菌微波消融針，外徑為18 G，針長18 cm，消融有效長度為3 cm。

1.3 實驗方法

（1）按甲狀腺乳頭狀癌根治術操作流程規范完成甲狀腺腺葉及峽部切除或全甲狀腺切除和相關區域淋巴結清掃[11]。（2）甲狀腺標本離體后即刻用手術刀將癌結節一分為二（圖1a、b），其中一份立即送病理科行術中快速及術后常規石蠟切片檢查和免疫組織化學染色，另一份即刻行微波消融干預（圖1c、d）。微波消融條件參照臨床甲狀腺結節熱消融操作流程[5]，輸出功率35 W，作用時間40 s。完成消融處理后立即行10%福爾馬林液浸泡，送病理科行常規石蠟切片檢查以及CK19、TTF-1 免疫組織化學染色。（3）免疫組織化學染色：取經甲醛溶液固定、石蠟包埋的手術切除癌組織標本，4 μm 厚連續切片，脫蠟，浸于0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液內，微波爐加熱至沸騰并保持該狀態15 min 修復抗原；切片冷卻后洗滌，采用邁新公司封閉緩沖液封閉非特異性背景染色；滴加邁新公司兔抗人CK19 或TTF-1 多克隆抗體（稀釋400 倍），4 ℃過夜；洗滌，浸于含0.3%H2O2的甲醇中滅活內源性過氧化物酶；洗滌，加入邁新公司抗兔二抗（稀釋1 000 倍），室溫反應15 min；洗滌后二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精輕染后封片。結果判定 CK19 或TTF-1 評分系統和標準：CK19 或TTF-1 蛋白主要定位于胞質。采用雙評分半定量分析，根據陽性細胞百分比及顯色程度計分。200 倍鏡下隨機取5 個視野，計算陽性細胞平均數，陽性細胞平均數為0 計0 分，≤25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，≥76%計4 分；顯色程度無著色計0分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分。兩種分數相加后綜合判定，0～1 分為（-），2～3 分為（+），4～7分為（++）。（-/+）為陰性，定義為CK19 或TTF-1 低表達；（++）為陽性，定義為CK19 或TTF-1 高表達。

圖1 新鮮離體甲狀腺癌結節的微波消融處理

1.4 觀察指標

（1）甲狀腺乳頭狀癌結節周圍正常腺體組織的濾泡形態；（2）癌結節的組織結構；（3）癌結節的細胞形態；（4）癌結節的TTF-1 和CK19 免疫組織化學表達。

1.5 統計學處理

應用SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料以x-±s表示，采用t檢驗，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微波消融對正常甲狀腺組織的影響

消融和未消融標本中癌結節周圍正常甲狀腺組織的濾泡形態無明顯差別。正常甲狀腺組織的濾泡結構、濾泡上皮細胞清晰可見。熱消融作用會使甲狀腺組織發生脫水和輕度擠壓變形，部分濾泡腔內膠質與濾泡上皮細胞分離，但不影響病理結果的判斷（圖2A、a）。

2.2 微波消融對甲狀腺乳頭狀癌組織形態和細胞結構的影響

消融和未消融標本的癌結節組織結構沒有明顯變化。所有消融后標本中甲狀腺乳頭狀癌的特征性乳頭狀結構依然清晰可見（圖2B、b）。消融和未消融標本的細胞形態沒有明顯變化。診斷甲狀腺乳頭狀癌的細胞核特征，如毛玻璃狀細胞核、核溝和核內包涵體等消融前后未發生明顯改變（圖3）。

圖2 甲狀腺癌結節微波處理前后比較（HE 染色，×100）

圖3 微波消融前后甲狀腺癌結節毛玻璃樣核比較（HE 染色，×200）

2.3 微波消融對甲狀腺乳頭狀癌標志物的影響

消融和未消融標本中甲狀腺乳頭狀癌標志物TTF-1 和CK19 表達沒有明顯變化，消融標本的免疫組化評分與未消融標本比較略有降低[TTF-1：（5.50±0.76）分vs（5.54±0.81）分；CK19：（5.38±0.85）分vs（5.50±0.81）分]，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 甲狀腺癌結節微波消融前后CD19 和TTF-1 免疫組織化學染色比較（HE 染色，×100）

2.4 微波消融后病理診斷符合率

微波消融后的26 個標本經病理診斷均明確為乳頭狀癌，與未行微波消融的標本相符，診斷符合率為100%。

3 討論

隨著高分辨率超聲的普及和人們健康意識的增強，甲狀腺結節的檢出率明顯升高，已成為臨床常見病之一。由于良惡性甲狀腺結節的治療原則和預后相差甚遠，大多良性結節可采取臨床觀察，而惡性結節多需行根治性手術，因此，甲狀腺結節的良惡性鑒別診斷具有重要的臨床意義。國內外多項指南都將US-FNA 推薦為甲狀腺結節良惡性鑒別的首選方 法[11-13]，但由于其穿刺取材量少（臨床實踐中取材不良率高達10%～30%），易受結節性質和血液干擾，以及細胞病理學診斷難度大等原因，約35%甲狀腺結節無法通過US-FNA 確定其性質，出現較高的假陽性和假陰性率[14-17]。與US-FNA 相比，US-CNB 可取出完整的組織條，組織標本量大，標本所具有的病理學信息更為豐富。雖然兩者具有相似的特異度和陽性預測值，但USCNB 的靈敏度和陰性預測值明顯高于US-FNA，其總體準確度也明顯高于US-FNA，因此，US-CNB 檢查對甲狀腺結節的診斷具有更高價值[8-9]。

由于甲狀腺血供豐富，每分鐘血流量可達150 mL，因此，行US-CNB 具有一個明顯的不足之處在于穿刺過程出血風險高，甚至出現危及生命的大出血，嚴重制約其臨床開展[18-19]。而在微波消融針作用下，甲狀腺組織血管內血液吸收微波能產熱，血液中的水份迅速蒸發，血液立即變稠和凝固，從而堵塞血管達到止血效果。因此，甲狀腺結節先行微波消融治療后再行即刻的US-CNB 理論上可以大大降低出血風險。作者應用UPMA 治療原發性甲狀腺功能亢進癥后即刻在超聲引導下行半自動活檢槍穿刺活檢，取材滿意率達100%，且無1 例在穿刺過程中出血[20]。但是，甲狀腺組織經微波消融治療后是否會使甲狀腺癌的病理特征溶解消失，降低US-CNB 的準確性，甚至產生假陰性和漏診，鮮有相關研究報道。

臨床上分化型甲狀腺癌約占成人甲狀腺癌的90%以上，其中乳頭狀癌是甲狀腺癌的最主要類型[21]。其病理診斷要點：（1）腫瘤組織呈復雜分支乳頭狀，含纖維血管軸心；（2）乳頭上皮細胞核呈毛琉璃狀，有核溝、核內假包涵體和核相互重疊；（3）砂粒體；（4）免疫組化CK19 和TTF-1 陽性[10]。如果甲狀腺乳頭狀癌結節經微波消融作用后，其病理診斷特征仍然存在，即乳頭狀癌診斷仍舊可以得到準確確立，則微波消融后即刻US-CNB 的準確性便可以得到保證。

熱量是迅速固定組織和細胞的一種手段。遇到60～100 ℃高溫時組織和細胞迅速發生變性失活，但是并未立即發生壞死。壞死是以酶溶性變化為特點的活體內局部組織中細胞的死亡[22]。組織變性失活后的壞死是一個漸進的過程。壞死過程中細胞結構不斷崩解，細胞形態逐漸喪失，最后變為無結構的凝固性物質。消融后腫瘤細胞的形態學特征不會立刻消失，至少在消融后一個月內仍可得以保存[23-24]。本研究結果證實了以上觀點，26 例甲狀腺乳頭狀癌結節離體后即刻將其一分為二，其中一份立即送病理科行常規石蠟切片檢查和免疫組織化學染色。另一份即刻按照臨床甲狀腺結節熱消融操作流程行微波消融干預，結果發現消融和未消融標本的正常甲狀腺組織的濾泡形態無明顯差別。所有消融后標本中癌結節周圍正常甲狀腺組織的濾泡結構、濾泡上皮細胞清晰可見。雖然，熱消融作用會使甲狀腺組織發生脫水和輕度擠壓變形，部分濾泡腔內膠質與濾泡上皮細胞分離，但不影響病理結果的判斷。消融和未消融標本的癌結節組織結構沒有明顯差異。所有消融后標本中甲狀腺乳頭狀癌的特征性乳頭狀結構依然清晰可見，毛玻璃狀細胞核、核溝和核內包涵體等特點消融前后未發生明顯改變。在未消融標本呈陽性表達的甲狀腺乳頭狀癌標志性組織化學物質CK19 和TTF-1 在所有消融后標本中均呈陽性表達。微波消融后的26 個標本經病理診斷均明確為乳頭狀癌，與未行微波消融的標本相符，診斷符合率達100%。

雖然熱消融后甲狀腺結節迅速發生脫水固定，標本可能出現擠壓變形，對診斷產生一定影響，但是不影響病理診斷的準確性，而且還具有以下優點：（1）對于質地松軟、膠質成分豐富或毛細血管豐富的結節，熱消融可以讓標本成型，更利于病理制作；（2）熱消融可以使甲狀腺組織內的血管發生攣縮閉合，因此對于動脈血管豐富的結節而言，消融后穿刺活檢可以減少出血的發生率。

綜上所述，微波消融不會造成術后甲狀腺病理組織中乳頭狀癌的相關病理特征的即刻喪失。因此，微波消融后立即行甲狀腺結節組織學活檢不會影響病理診斷的準確性。臨床上可選擇微波消融后即刻USCNB，不但不影響結節活檢標本病理診斷的判定，而且可降低粗針穿刺過程中出血的發生率。