生防菌劑鏈霉菌JD211對水稻土壤微生物群落結構及碳代謝的影響

彭海龍，徐天宇，鐘秉峰，李 濤，孟麗媛，魏賽金*

（1.江西農業大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.江西農業大學 應用微生物研究所，江西 南昌 330045）

【研究意義】近幾十年來，人們為促進作物生長免受病蟲害干擾，會過度使用化肥和殺菌劑，這種做法不僅會造成化肥殘留，危害人畜的健康，而且在有效殺害病原菌的同時還會殺害其他有益微生物，破壞土壤生態平衡[1]。生物防治作為一種綠色、可持續發展的病蟲害防控方法，強調生態環境和人類健康的良性循環和發展[2]，可通過有益微生物定殖于土壤來抑制土傳病害，同時促進植物的生長。其中，具有抑菌性潛力的植物內生菌已被廣泛用于土壤病害的防治，如芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、木霉屬(Trichoderma)以及菌根真菌(mycorrhizal fungi)，這些內生菌可以通過抗生、競爭、溶菌、重寄生、誘導植物產生抗病性和優化土壤結構來抑制病原菌的生長[3]?！厩叭搜芯窟M展】鏈霉菌是一種革蘭氏陽性細菌，它的孢子可以直接與革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的菌落相互作用而轉移到植物組織中[4]。Abbasi 等[5]在蔬菜溫室土壤中施加生防菌劑，發現鏈霉菌IC10對番茄枯萎病的防治比施用多菌靈提高了12.5%。馬云艷等[6]研究發現，在棉田土壤中施用黃三蘇鏈霉菌(Streptomyces flavotricini)和棉稈炭的組合，可以改變土壤中優勢微生物的數量和比例，增強土壤防病促生作用。

【本研究切入點】水稻土是我國重要的耕作土壤，約占全國作物耕地總面積的1/5，其在農業系統固碳過程中發揮著不可或缺的作用[7]。土壤有機碳(SOC)是最大的陸地碳庫，在穩定土壤肥力、緩解氣候變化和維持微生物代謝方面發揮重要作用[8]。土壤有機碳含量可能會受微生物代謝調控，Bouskill等[9]認為土壤呼吸向大氣中排放CO2可能是土壤有機碳分解主要過程，Bastida等[10]也認為任何嚴重失衡的微生物群落關系都可能會加快土壤有機碳的消耗，但土壤微生物群落對碳循環的影響仍然存在爭議。在前期的研究中，課題組從珙桐植株中分離得到一株奈良鏈霉菌(Streptomyces naraensis），命名為鏈霉菌JD211。該菌株對水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、葡萄炭疽病和煙草黑脛病等土傳病害具有較強的抑制作用，制成生防菌劑施用于土壤還能促進水稻幼苗的生長[11]，但其對土壤微生物群落結構和代謝活性影響尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究以不加菌劑的水稻土為對照，添加不同濃度鏈霉菌JD211，采用氣相色譜和Biolog-ECO 方法分析生防菌劑對水稻土壤微生物活性、碳源利用能力以及微生物群落組成的效應，旨在明確鏈霉菌JD211 對水稻土壤微生物群落結構和代謝活性的影響，以期為其在農業生防應用上提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用土壤采自江西農業大學水稻試驗田（28°46′22″N，115°49′57″E）的表層（0～20 cm）。選取5個點采集土樣，將樣品風干后混勻，研磨過篩網（2 mm）。土壤質地為粉壤土（黏土28.5%、粉土56.2%、沙土15.3%），土壤堆積密度（BD）1.12 g/cm3、pH 5.58、總氮（TN）1.67 g/kg、有機碳（SOC）13.71 g/kg。

鏈霉菌JD211生防菌劑采用固態發酵[11]，低溫烘干后粉碎過篩（0.25 mm），活菌數為2.5×108cfu/g，有機碳含量為16.23 g/kg。

1.2 土壤培養試驗

根據菌劑與土壤質量比設置3 個處理，分別為0%（CK）、2%（B2）和4%（B4），每個處理3 個平行。在500 mL玻璃瓶中裝入100 g風干土壤，按比例加入生防菌劑與土壤充分混勻，并將一定體積的（NH4）2SO4溶液均勻噴灑在土壤表面，使土壤孔隙容積含水量（WFPS）和外源氮含量（按大田150 kg/hm2）分別達到0.5 mg/kg 和75 mg/kg。用封口膜封住瓶口，放置生化培養箱（25±1）℃黑暗培養15 d，并按稱重法補充水分[12]。每天09:00 采集氣體測定CO2濃度，并在培養時間為1，9，15 d 時采集土樣用于有機碳測定和Biolog 分析。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤CO2排放速率測定 將玻璃瓶置于環境空氣中30 min，使其充滿環境空氣，然后蓋上帶三通閥塑料通氣管的橡膠蓋子，氣密1 h，并分別在三通閥關閉前后采集氣體樣品30 mL。使用氣相色譜儀（Agilent，7890B，USA）測定氣體CO2的濃度[13]，參照文獻[14]計算CO2釋放速率。

1.3.2 土壤有機碳測定 采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定土壤有機碳含量[15]。

1.3.3 Biolog-ECO 測定 土壤微生物群落代謝功能多樣性采用Biolog-ECO 生態板分析。稱取新鮮土樣10 g，加入到裝有90 mL 滅菌的生理鹽水中，200 r/min 振蕩30 min，靜置20 min 后吸取上清液稀釋。取上清液的10-3稀釋液150 μL 到生態板孔中，25 ℃培養5 d，每隔24 h 用Biolog 儀測定590 nm 和750 nm 處的吸光值。參照文獻[16]計算平均每孔顏色變化率（AWCD）。

選取48 h微平板培養的數據，計算土壤微生物代謝功能的多樣性，以及對不同碳源的利用率。采用Shannon 指數（H）、Mclntosh 指數（U）、Simpson 指數（D）、Pielou 指數（J）表示微生物群落代謝多樣性的差異[17-18]。具體計算公式如下：

式中，Ci為第i個非對照孔的吸光度，R則為其對應的吸光值；Pi為第i個非對照孔的相對吸光值與所有非對照孔的相對吸光值總和的比值；S為被利用的碳源總數；ni表示第i個孔的相對吸光值。

1.4 數據分析

實驗數據采用Excel 2019進行處理分析，用SPSS 26.0進行方差分析和主成分分析，采用Origin 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 生防菌劑對水稻土壤微生物活性的影響

土壤CO2排放速率隨著土壤培養時間的增加，總體趨勢逐漸下降，且呈現一定的階段性特征（圖1）。第一階段為1～2 d，CO2排放速率迅速下降，第二階段為3～9 d，土壤釋放CO2的速率開始出現平緩下降的趨勢，第三階段為11～15 d，此時CO2釋放速率下降的幅度更為平緩。在各個階段中不同處理的土壤CO2排放速率由高到低表現為B4、B2、CK（P＜0.01），說明添加固體菌劑后，土壤微生物群落可能發生了改變，土壤微生物的呼吸和代謝活力增強，使水稻土壤排放的CO2速率增強。而隨著培養時間的增加，土壤微生物活性逐漸降低，CO2排放速率趨于平緩，這可能與微生物在有限環境容量中生長會受到抑制有關[19]。

2.2 生防菌劑對水稻土壤有機碳的影響

由表1 可知，添加生防菌劑后水稻土壤有機碳含量顯著提高（P＜0.05）。在土壤培養1 d 時，B2、B4組土壤有機碳含量較CK 組分別增加10.2%、17.2%；在9 d 時，B2、B4組土壤有機碳含量相較于CK 組分別增加了19.2%、19.9%；在15 d 時，B2、B4組土壤有機碳含量較CK 組分別增加了19.3%、23.1%。說明菌劑施加于土壤后，可能改變了微生物群落的構成，使土壤中參與有機碳合成的微生物群落活性增強[20]。

表1 水稻土壤有機碳含量Tab.1 Organic carbon content of rice soil

2.3 土壤微生物利用碳源的動力學分析

由圖2可知，土壤微生物消耗的碳源量，總體趨勢是逐漸增加的，平均每孔顏色變化率（AWCD）值變化規律符合“S”型曲線，但生防菌劑不同施入量和不同采樣時間的土壤平均顏色變化率存在較大的差異。在0～48 h 時，不同采樣時間點的B2、B4的AWCD 值的增長速率大于CK，48 h 時差異極其顯著（P＜0.01）；在72～120 h 時，CK 組的增長速率顯著高于B2、B4組（P＜0.05）。對于不同時間點，土壤微生物指數生長階段的變化存在差異，在48 h 時（圖2A），AWCD 值由低到高為CK、B4、B2（P＜0.01），此時1 d 采樣點的CK組和B2組的有機碳含量均大于15 d的（表1），說明生防菌劑施入土壤后，外源微生物與土壤原始群落開始了激烈的競爭反應，隨著時間的增加土壤微生物的活性逐漸降低，最后進入穩定狀態[19]。

圖2 不同處理水稻土壤AWCD值和AWCD速率變化Fig.2 Changes of AWCD value and AWCD rate of rice soil under different treatments

根據AWCD 曲線總體的變化趨勢，48 h增長速率最大，之后曲線增長趨勢開始減緩。土壤微生物在此時Biolog-ECO 生態板的培養時間可以最大限度滿足其活性，在一定程度上可更準確地反映不同樣品土壤微生物的差異性，所以選取該時間點的數據，進一步分析生防菌劑施入后對各類碳源的利用能力。

2.4 土壤微生物群落代謝多樣性分析

根據培養48 h 的AWCD 值計算得到不同取樣時間點和處理之間的代謝多樣性指數（表2）。B2、B4組的Shannon 指數、Mclntosh 指數和Simpson 指數顯著高于CK 組（P＜0.05），而Pielou 指數顯著低于CK 組（P＜0.05）。在1 d 時，B2組和B4組的Mclntosh 指數和Pielou 指數差異顯著，分別為B2＞B4、B4＞B2（P＜0.05），而在9 d、15 d時各多樣性指數差異并不顯著（P＞0.05）。CK 組、B2組隨著培養時間的增加，Shannon指數、Mclntosh 指數和Simpson 指數均出現顯著下降，且CK 組的下降速度顯著高于B2組（P＜0.05），而B4組無顯著變化（P＞0.05）。

表2 水稻土壤微生物群落代謝多樣性指數Tab.2 Diversity index of rice soil microbial community

施加生防菌劑，提高了土壤微生物群落代謝多樣性，說明生防菌劑的施加影響了土壤原始微生物的定殖，這可能和土壤微環境穩定性受到改變有關。

2.5 土壤微生物群落利用不同類型碳源的特征分析

Biolog-ECO 生態板上的31 種碳源根據其化學基團的性質，可分為六大類，即糖類（7 種）、氨基酸類（6 種）、酯類（4 種）、胺類（3 種）、醇類（3 種）和酸類（8 種）[18]。選取培養時間為48 h 的數據計算不同土壤微生物群落對這6 類碳源的相對利用率，B2、B4組對6類碳源的相對利用率較為平衡，而CK組對酯類利用率較高，對糖類的利用率極低。隨著取樣時間點的延長，B2、B4處理組對糖類、醇類和胺類這3類碳源利用率高于CK組；酯類則相反，B2、B4＜CK（P＜0.05）；而對氨基酸類和酸類，隨著培養時間的增加CK 與B2、B4無顯著差異（P＞0.05）（圖3）。

圖3 微生物群落對各類碳源相對利用率Fig.3 Relative utilization of various carbon sources by microbial communities

通過不同時間點相同處理之間的比較，可以發現CK、B2和B4組的土壤微生物對醇類的利用相對穩定，而對于酯類和酸類，B2、B4和CK 組之間則存在差異。在酯類的利用上，CK 組隨著培養時間的增加，利用率越高；在酸類的利用上，B2、B4組在9 d時達到了最大。

由此可知，水稻土壤原始微生物群落對Biolog-ECO 生態板上的酯類碳源最為敏感，對氨基酸類、酸類其次，對糖類碳源不敏感。施加了生防菌劑后，土壤微生物對糖類、醇類和胺類這3 類碳源利用率提升?？赡苁侨肭秩郝浜驮既郝浒l生了競爭關系，穩定后所形成的土壤微生物群落對碳源類型的利用模式發生了改變[10]。

2.6 土壤微生物碳源利用的主成分分析

選取Biolog-ECO生態板培養48 h的AWCD值，對不同取樣時間和不同處理之間，土壤微生物利用單一碳源的特性進行主成分分析。依據PCA 提取原理，提取到多個主成分。其中，第1 主成分（PC1）為68.2%，第2主成分（PC2）為12.4%，2個主成分累計貢獻率達到80.6%，其余主成分貢獻率相對較小，所以只分析PC1和PC2（圖4）。由圖4可知，CK 組的不同取樣時間點主要分布在第一象限，而B2、B4組主要分布在第四象限，這說明處理組與CK 組相似程度較低，對碳源的利用能力及土壤微生物群落之間存在較明顯的差異。而CK 組中取樣時間為9 d 和15 d 的兩組成分距離較為接近，B4組的不同取樣時間點之間又相較于B2組距離較近。這說明隨著土壤培養的時間增加，不同組別土壤微生物利用碳源能力的穩定性存在區別，由高到低表現為B4、B2、CK。

圖4 不同微生物群落主成分分析Fig.4 Principal component analysis of different microbial communities

進一步將主成分得分系數與31 種碳源進行相關性分析，31 種碳源與PC1 都呈正相關，相關系數大于0.7的碳源有22種，其中，糖類3種，氨基酸類6種，酯類2種，醇類2種，胺類2種，酸類7種。有15種碳源與PC2呈正相關，其中β-甲基-D-葡萄糖苷和D、L-a-甘油磷酸酯這兩種碳源與PC2相關系數達到0.7以上，分別屬于糖類和醇類。以上碳源對微生物組群區分的貢獻率較大，表明土壤微生物群落對這些碳源的代謝存在差異（表3）。

表3 31種碳源與主成分之間的相關系數Tab.3 Correlation coefficients between 31 carbon sources and principal components

3 討論

3.1 生防菌劑施加對水稻土壤微生物代謝的影響

生物防治菌劑可通過產生抗生素、毒素、表面活性物和胞外降解酶（如蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶）達到抑制土壤病原菌生長的目的。在土壤中施用生防菌可能會改變土壤原有微生物群落的結構和功能[17]，刺激微生物的代謝活力，并影響土壤有機碳儲量的質量和水平[19]。微生物呼吸是微生物通過分解有機物質并產生一定能量的過程，呼吸作用的強弱在很大程度上反映著微生物的總活性[21]。本研究表明，施加生防菌劑的水稻土壤CO2釋放速率顯著增高，說明外源菌劑的添加會增強原始微生物群落的代謝活性，這與李青梅等[22]的研究一致。此外，本研究還發現，施加生防菌劑可以顯著提高水稻土壤有機碳的含量（P＜0.05）。在土壤培養9 d 時，3 組土壤有機碳含量相較于1 d 均有所下降，而到15 d 時含量均呈現上升趨勢，這可能是因為外源微生物的“侵入”使其與土壤原始微生物群落相互競爭生態位，土壤微生物的群落組成和結構改變在一定程度上影響土壤有機碳固定[23]，使得土壤有機碳含量在這段時間內呈下降；而后隨著土壤微生物群落趨于穩定，參與有機碳合成的微生物群落活性增強[20]，引起土壤有機碳含量增加；若繼續培養有機碳含量可能會逐漸趨于穩定，具體的調節機制還需進一步地研究證明。吳文輝等[24]研究發現，隨著還田時間延長，以番茄秸稈（TS）和甘藍葉殘體（CR）為還田廢棄物的各處理的土壤有機碳含量略微降低，并趨于穩定。錢壯壯等[20]研究發現，在土壤中添加由芽孢桿菌、放線菌、酵母菌組合的復合菌劑會顯著增強土壤的呼吸作用以及提高有機碳的含量，并在培養后期土壤仍會維持較高的呼吸速率。冷雪梅等[7]研究發現，未經處理的水稻土壤呼吸速率和有機碳分解處于一種較穩定的狀態。究其原因可能是生防菌的引入給土著微生物群落帶來了環境壓力，在這種壓力下會迫使某些微生物種群組成發生改變或使其休眠，微生物群落將表現出不穩定性[25]，土壤微生物活性和分解有機碳能力受到一定程度的影響。但是土壤CO2釋放速率實際上反映的是有機碳礦化的速率，與真實微生物呼吸存在一定偏差，需要結合土壤O2消耗速率一起探究微生物的活性[21]。

3.2 生防菌劑施加對水稻土壤微生物群落的影響

土壤微生物群落是土壤生態環境的重要組成部分[1]，通過調節土壤功能來維持生態系統的穩定性。在水稻土壤中施加生防鏈霉菌，屬于人為添加的外界環境壓力，外來微生物與土著微生物之間會進行生態位的爭奪，從而影響土壤微生物群落的穩定性[26]。Biolog 方法是基于測定土壤微生物對不同碳源利用能力的差異來表征群落代謝功能的變化[27]，平均每孔顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物利用碳源的能力，其值可以用來表征土壤微生物的活性。AWCD 值越高，則說明土壤微生物利用碳源的能力越強，微生物具有的活性越強[18]。本研究表明，施加生防菌劑的B2、B4組AWCD 值顯著高于CK 組（P＜0.05），說明在水稻土壤中施加生防菌劑可以提高微生物的活性。通過分析土壤微生物群落代謝的多樣性指數能夠較敏感、快捷地表征土壤微生物群落特征的變化[28]，也可用作土壤環境穩定性和土壤質量健康的評價指標，在本研究中，B2、B4組的Mclntosh 指數相較于CK 組達到了極顯著水平（P＜0.01），而Shannon 指數和Simpson 指數也顯著高于CK 組（P＜0.05），這與余賢美等[17]結果一致。馮發運等[16]研究發現，在施有多菌靈的水稻土壤中接種水稻內生降解菌（寡養單胞菌）可以調高土壤中多菌靈的代謝，同時提高土壤微生物的AWCD 值和群落的多樣性指數。白瑩等[29]研究發現，在種植木麻黃的土壤中分別施加解淀粉芽孢桿菌（YB706）和伯克氏菌（BK8），兩種菌劑都顯著提高土壤微生物群落代謝多樣性指數。在原始土壤環境中，微生物豐富度、多樣性越高，土壤生態系統的抗干擾能力就越強，更具有穩定性[1]。但外源微生物入侵引發的多樣性提升與土壤生態系統本身穩定性之間的關系還不明確，不能說明施入生防菌劑可以優化土壤生態系統的穩定性。

3.3 生防菌劑施加對微生物群落碳源利用能力的影響

土壤微生物群落利用碳源的代謝強度和代謝類型的變化在一定程度上能夠預測土壤養分變動趨勢，是土壤質量健康評價極具潛力的生物指標[27]。本研究表明，水稻土壤原始微生物群落對酯類、氨基酸類和酸類更為敏感，而施加生防菌劑后，微生物群落對糖類和胺類的相對利用率有了顯著提升，對各類型碳源的利用變得更加均衡。主成分分析可以用來評估土壤微生物群落對碳源的利用狀況，以及區分各處理微生物群落之間的主要差異[16]。從PCA 分析結果可知，施加生防菌劑的B2、B4組微生物群落與CK組差異顯著。而隨著培養時間的增加，B2、B4處理相較于CK處理土壤微生物群落變動幅度小，更加趨于穩定。其中氨基酸（苯丙氨酸）、胺類（苯乙胺）和酸類（D-氨基葡萄糖酸）這3 種碳源對PC1 作出貢獻最大。Angst等[8]通過研究發現，在土壤礦物組分中，植物特有的糖類和酯類占有機碳比例高達10.0%，而含氮化合物氨基酸和部分酸類會選擇性結合到礦物表面形成難降解化合物，不易被生物分解和礦化。Cotrufo 等[30]也認為如果土壤中難降解化合物的濃度低，將在一定程度上提高土壤微生物生物量以及土壤微生物對基質的利用效率，最終微生物群落的代謝殘留物會與土壤礦物相互作用形成有機質。本研究中，處理組對氨基酸類和酸類這兩類碳源的代謝能力增強，說明生防菌劑的引入改變了微生物群落結構和功能，可能在一定程度上降低了難降解化合物的濃度，從而提高了土壤有機碳的含量。但是土壤微生物群落本身很復雜，各物種之間又存在相互作用[25]，而Biolog 方法只能測定部分環境微生物群落的變化（具有一定的選擇性），今后還需要結合微生物組學的方法，更深入的探究生防菌劑給水稻土壤微生態帶來的變化。

4 結論

施加生防菌劑鏈霉菌JD211 可以提高土壤有機碳的含量，有助于水稻土壤有機碳的固存。生防鏈霉菌JD211 的施入提高了土壤微生物群落的Shannon 指數、Mclntosh 指數和Simpson 指數，并改變了微生物群落碳代謝能力，使其對各類型碳源的利用更加均衡，這對于微生物源農藥調控微生物群落結構，明確其生態功能具有重要指導意義。