硫氰酸鹽高效降解菌群的動力學及微生物多樣性研究

汪流偉，肖小雙，安雪姣，李寧健，謝 東，張慶華

（江西農業大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】硫氰酸鹽是一種在金礦開采和焦化工業過程產生的含碳、氮、硫等元素的常見化合物，排放濃度高達5 000 mg/L，具有較強的毒性和化學穩定性[1-2]，其主要是通過抑制多種酶的活性，使得多種生物受到迫害[3]，對生活環境造成了極大的危害。鑒于其毒性和來源廣泛，工業排放指令規定，硫氰酸鹽在焦化廢水中的排放濃度必須降低至4 mg/L，為此，硫氰酸鹽降解研究就顯得尤為重要[4]?！厩叭搜芯窟M展】經研究發現，通過物理、化學和生物方法可有效去除硫氰酸鹽[5]，其中物化法效果較差，實施成本較高，有時還會產生二次污染，不能達到排放的標準[6-9]；相比之下，由微生物介導的生物法去除硫氰酸鹽具有低成本、高效率、降解完全、不產生二次污染等優點，也是當前國內外研究的主要方法之一。具備降解硫氰酸鹽的微生物已從多種來源中分離和鑒定，如Arthrobacter、Klebsiella、Pseudomonas、Ralstonia、Thioba-cillus thioparus、Thioalkalivibrio thiocyanoxidans、Paracoccus thiocyanatus等[10-13]，這些微生物利用硫氰酸鹽作為能量和碳、氮、硫源[14-15]，可在不同程度上實現硫氰酸鹽的降解?！颈狙芯壳腥朦c】與僅借助單一微生物降解硫氰酸鹽相比，含有多種微生物的活性污泥的去除具有更穩定、更高的去除率[16]。有研究表明，以硫桿菌為主的微生物群落在連續流動反應器中的最大硫氰酸鹽去除率為1.07 mmol/（L·h）[17]；用于自養硫氰酸鹽去除的微生物群落也以硫桿菌屬物種為主，能夠在5 d 內將2 109 mg/L 降解到890 mg/L[18]。這些研究始終檢測到硫桿菌屬的細菌是降解菌群中的關鍵菌群，主要參與硫氰酸鹽的降解，但是關于復合菌群的降解動力學和生長動力學及降解硫氰酸鹽的細菌群落結構了解甚少，對其進行分子生態學研究，為處理實際含硫氰酸鹽廢水提供新見解?！緮M解決的關鍵問題】本課題組前期從焦化工業廢水中富集馴化獲得了一組降解速率快、酶活高且結構穩定的硫氰酸鹽高效降解復合菌群。該菌群可在27 h內將3 g/L硫氰酸鹽完全降解，且可在11 d內將12 g/L硫氰酸鹽完全降解，遠超現有文獻報道的最高水平（7 g/L，12 d）[19]。在此基礎上，對復合菌群降解硫氰酸鹽速率和菌群生長速率進行動力學分析；采用高通量測序技術，對復合菌群微生物多樣性分析及其馴化富集前后的群落結構的演替變化，確定其優勢菌群，以期為含高濃度硫氰酸鹽廢水處理提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 復合菌群來源 本課題組前期從江西省豐城市新高焦化廠的初曝池取樣后富集馴化得到的高效降解復合菌群。

1.1.2 培養基 無機鹽培養基[20]：NaCl 0.15 g/L，MgSO40.15 g/L，FeSO40.075 g/L，CaCl20.01 g/L，K2HPO41.1 g/L，KH2PO41.1 g/L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 硫氰酸鹽檢測方法 硫氰酸鹽檢測采用鐵比色法[21]。

1.2.2 生物量檢測 將發酵液在4 ℃下8 000 r/min 離心5 min 后收集復合菌群，菌群經蒸餾水3次潤洗，離心后再次收集菌群。菌群在室溫下干燥后稱重。復合菌群生物量計算公式：

1.3 不同初始濃度對復合菌群的影響

將活化的復合菌群按10%（V/V）的接種量接種至分別以硫氰酸鹽初始濃度為0.1～15 g/L的無機鹽培養基中，在其他條件保持一致的情況下探究復合菌群降解硫氰酸鹽及菌群生長的影響。

1.4 硫氰酸鹽降解復合菌群的微生物多樣性分析

將原始活性污泥與復合菌群菌液離心，將洗滌后的污泥與復合菌群由北京百邁克公司用于細菌總DNA 的提取、PCR 擴增和16S rRNA 測序分析。采用引物27F5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′和1492R5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′進行PCR 擴增?？侱NA 提取按照土壤基因組DNA 抽提試劑盒進行。通過數據處理對物種進行注釋及分類學分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、組間差異顯著性分析、相關性與關聯性分析[22]。

1.5 試驗設計與數據統計分析

采用origin繪圖軟件進行繪圖，利用SPSS Statistics 25.0進行數據統計分析，每組試驗3次重復。

2 結果和討論

2.1 不同初始硫氰酸鹽濃度對復合菌群的影響

硫氰酸鹽在一定濃度下對多種酶有抑制作用，因此，硫氰酸鹽初始濃度過高時，研究其耐受性是必要的[23]。為了深入探究硫氰酸鹽初始濃度對降解率及生長速率的影響，選取濃度范圍0.1～15 g/L 的硫氰酸鹽進行分析，其結果如圖1所示，當硫氰酸鹽初始濃度在0.1～1 g/L 時，復合菌群降解速率越來越快；但隨著硫氰酸鹽初始濃度的提高（2～15 g/L），復合菌群降解速率越來越慢，這可能是復合菌群經歷了一段適應期，且硫氰酸鹽濃度越高，適應期越長。同樣，當硫氰酸鹽初始濃度在1～4 g/L 時，復合菌群生長速率越來越快；當濃度進一步提高時（5～15 g/L），復合菌群生長速率越來越慢。在低濃度時（1 g/L），復合菌群降解硫氰酸鹽及其生長不受底物限制，當提高濃度（4 g/L），復合菌群的生長速率依舊處于上升的趨勢，但降解速率卻在降低，結果表明復合菌群生長速率并不完全吻合于復合菌群降解硫氰酸鹽速率。

由圖1可知，隨著硫氰酸鹽濃度的逐漸增加，降解所需時間顯著延長，硫氰酸鹽降解速率和復合菌群生長速率均呈先增后減的趨勢。由此說明高濃度硫氰酸鹽對該復合菌群的降解及生長具有一定的抑制作用。因此，可以采用底物抑制模型-Haldane方程來描述該復合菌群的降解及生長的動力學方程（方程式如下）。隨后利用硫氰酸鹽降解時間和降解速率（復合菌群生長速率）進行擬合，結果如表1所示，硫氰酸鹽降解速率（菌群生長速率）和降解時間符合線性關系，故該復合菌群對硫氰酸鹽的降解動力學和菌群生長動力學符合一級反應動力學。

表1 復合菌群對硫氰酸鹽降解及細菌生長的動力學方程及參數Tab.1 Kinetic equation and parameters of thiocyanate degradation and microbial growth of the microbial community

圖1 復合菌群對不同濃度硫氰酸鹽的降解性能Fig.1 Degradation of thiocyanate at different concentrations by microbial community

式中，V為降解速率[g/（L·h）]，S為硫氰酸鹽初始濃度（g/L），Vmax為硫氰酸鹽的最大降解率[（g/（L·h）]，Ki為底物抑制常數（g/L），Ks為底物飽和常數（g/L）。Vopt為硫氰酸鹽的最佳降解速率/最佳生長速率[g/（L·h）]，Sopt為硫氰酸鹽的最佳降解/生長濃度（g/L）。

分別對不同硫氰酸鹽濃度下初始階段降解速率和菌體生長速率的實驗值與理論值進行擬合，結果如圖3 所示，相關系數R2分別為0.916 51 和0.941 28，說明擬合效果較好。隨著硫氰酸鹽濃度的不斷升高，降解速率和生長速率也依次增大，直到達到最高點即存在最大降解速率Vmax和復合菌群最大生長速率Vmax分別為0.148 79 g/（L·h）和0.236 46 g/（L·h），底物抑制常數Ki分別為32.845 5 g/L 和5.928 0 g/L，底物飽和常數Ks分別為0.051 74 g/L 和1.337 59 g/L，如表2 所示。代入公式計算，得到最佳降解速率Vopt與最佳硫氰酸鹽濃度Sopt分別為0.137 85 g/（L·h）、0.121 26 g/L，最佳菌群生長速率Vopt和最佳硫氰酸鹽濃度Sopt分別為1.278 28 g/（L·h）、2.784 68 g/L，這些結果與圖2的峰值點基本一致。

表2 復合菌群降解硫氰酸鹽動力學及細菌群落生長動力學參數Tab.2 Parameters of thiocyanate degradation and microbial community growth kinetics

圖2 復合菌群的霍爾丹模型擬合曲線Fig.2 Fitted curves of Haldane model of microbial community

高濃度硫氰酸鹽降解速率的降低可能是因為底物濃度高、毒性大，難以被微生物快速利用，其次還可能是高濃度硫氰酸鹽阻止了酶的活性區域，降低酶活，從而阻礙了生物降解和復合菌群生長。表明復合菌群在硫氰酸鹽降解過程中符合底物抑制模型，進一步明確了硫氰酸鹽降解模型的適用性。這與黃會靜[24]等研究結果相似，但是其研究的硫氰酸鹽底物濃度最大為3 227.21 mg/L，本研究的最高濃度為15 g/L。眾所周知硫氰酸鹽在實際廢水中的含量僅有0.5～3 g/L，但該復合菌群可降解15 g/L的硫氰酸鹽，遠超報道的最高水平70 mmol[19]，并且能保持較高的降解效率。這為后期利用復合菌群處理高濃度復雜的實際硫氰酸鹽廢水提供了重要的理論支持。

2.2 硫氰酸鹽降解復合菌群微生物多樣性分析

2.2.1 硫氰酸鹽降解復合菌群群落結構多樣變化 為了分析硫氰酸鹽降解復合菌群與原始活性污泥的細菌群落結構以及豐富度，在97%相似水平上計算了常見的多樣性指數。原始活性污泥和復合菌群細菌多樣性指數（表3），覆蓋率指數是樣品的測序深度也表明樣品的覆蓋率，6 個樣品的覆蓋率分別是0.997 4、0.998 5、0.998 2、0.999 2、0.999 2 和0.998 7，表明絕大部分的細菌種群都被檢測出來。隨著硫氰酸鹽降解菌群的富集馴化，降解菌群中的細菌多樣指數隨之減少，如原始的活性污泥經過培養馴化后，生物分類單元（OTUs）從87、89、84 降為44、44、40，香農指數也從2.667 8、2.857 4、2.714 3 減為1.512 6、1.813 8、1.393 1，這表明細菌多樣性及結構在復合菌群中發生了改變，不斷提高硫氰酸鹽濃度對群落結構產生脅迫壓力，使其生物多樣性減少。而保存下來的這部分微生物有些可能是硫氰酸鹽降解菌，還有些可能與保持污泥穩定性相關，也有可能是它們可以利用硫氰酸鹽降解的產物或者次級產物進行生存。

表3 細菌群落多樣性指數Tab.3 Diversity indices of bacterial community

2.2.2 硫氰酸鹽降解復合菌群群落組成變化 如圖3（a）所示，原始污泥的優勢菌門主要有Acidobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes。其豐度大約為：57.95%、22.05%、12.49%、1.32%;復合菌群的優勢菌門主要有Proteobacteria、Bacteroidetes、Patescibacteria、Armatimonadetes，其豐度大約為：81.04%、14.46%、1.80%、1.34%，這與Wang 等[19]的研究結果相似。其中復合菌群獨有的Patescibacteria 已被報道其常與反硝化菌共存[25]，Armatimonadetes 對廢水中酚類物質具有較好的降解效果[26-27]。Acidobacteria 在復合菌群中消失的原因可能是在硫氰酸鹽脅迫下由于不能有效的利用硫氰酸鹽而逐漸被淘汰，有研究表明Acidobacteria 與環境中的C 和N 含量成反比[28]，這也解釋了在硫氰酸鹽降解過程中氨氮濃度越來越高的原因。Proteobacteria 在原始污泥和復合菌群中都是優勢菌門，且在富集馴化過程中豐度明顯提高，這說明其在硫氰酸鹽的脅迫下不受影響，而且能很好地代謝繁殖[29]。同樣Bacteroidetes 也是原始污泥和復合菌群中共有的優勢菌門，在后期富集馴化過程中豐度無明顯差異，說明Bacteroidetes 能適應硫氰酸鹽的脅迫，唐濤濤[30]發現其可降解多環芳烴。

如圖3（b）所示，原始污泥中的優勢菌屬及其豐度為：Uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae、Alicy-cliphilus、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、Diaphorobacter、uncultured _bacterium_f_Mitochondria、Thiobacillus。其豐度大約為：57.95%、12.40%、5.98%、2.80%、2.93%、2.69%;復合菌群中優勢菌屬和豐度分別為：Thiobacillus、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、Dokdonella、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae。其豐度大約為：77.73%、6.16%、5.63%、2.09%、1.80%。在復合菌群中，原始污泥中的優勢菌群Alicycliphilus、uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae和Diaphorobacter均未出現，表明這些菌屬不能生存在硫氰酸鹽的脅迫下。Thiobacillus已被廣泛報道能有效降解硫氰酸鹽，且是含硫氰酸鹽廢水處理系統中的關鍵菌屬，亦可利用H2S 作為能源生長[31-32]，在復合菌群中其豐度大約為77.73%，而在原始活性污泥中其豐度大約為2.69%，結果表明Thiobacillus可能是硫氰酸鹽主要的降解菌屬。Dokdonella、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae和WPS-2在菌群富集馴化過程中出現，說明這些菌屬可以協同利用硫氰酸鹽或其降解物生長代謝。uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group豐度在富集馴化過程中沒有明顯改變，這可能是該菌屬可以在高濃度硫氰酸鹽脅迫下生長代謝。不同的細菌具有不同污染物降解的功能，同一種細菌也可具有降解多種不同污染物的功能，如Thiobacillus不僅能降解硫氰酸鹽，還具有很強的反硝化能力[33-34]?？偟慕Y果表明兩組樣品中不同屬在不同樣品中的豐度不同，有些菌屬的豐度會有變化，說明細菌種群在高濃度硫氰酸鹽脅迫下有一定的適應性，群落結構可以通過自身的組成變化適應高濃度硫氰酸鹽環境。這也進一步說明該復合菌群的適應性強，這對處理成分復雜的實際硫氰酸鹽廢水具有極大的優勢。

圖3 門/屬水平上的細菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community at phylum/ genus level

3 結論

（1）研究發現硫氰酸鹽降解菌群的降解動力學和生長動力學均符合Haldane模型，最佳降解速率Vopt值和最佳硫氰酸鹽濃度Sopt為0.137 85 g/（L·h）、0.121 26 g/L；最佳復合菌群生長速率Vopt值和最佳硫氰酸鹽濃度Sopt分別為1.278 28 g/（L·h）、2.784 68 g/L。

（2）復合菌群中發現Thiobacillus、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae、Dokdonella等菌屬的豐度較高，其中，Thiobacillus由活性污泥的劣勢菌屬（豐度大約為2.69%）變為復合菌群的優勢菌屬（豐度大約為77.73%），被認為是復合菌群降解硫氰酸鹽的關鍵菌屬。

本研究結果可為復合菌群在硫氰酸鹽廢水的實際處置提供研究基礎和技術支撐。