野燕麥對精噁唑禾草靈的敏感性水平及其ACCase基因序列分析

王祥宇 郝巧巧 遠鑫洋 劉潤強 王洪亮 張佩

摘要：為明確麥田野燕麥對精噁唑禾草靈的抗藥性水平及抗性種群的靶標抗性機制，采用整株生物測定法對河南省不同地區的30個野燕麥種群的敏感性水平進行測定，同時對抗性野燕麥種群的靶標ACCase 基因片段進行擴增和測序。最終研究表明：供試種群中有5個對精噁唑禾草靈產生了高水平抗性，11個產生了中等水平抗性，11個產生了低水平抗性，3個為敏感種群。其中抗藥性最高的種群是HZXH，用整株生物法測定后，精噁唑禾草靈對該種群的有效抑制中劑量（ED50）值為143.66 g a.i./hm2，相對抗性倍數為21.31。河南省不同地區的野燕麥種群對精噁唑禾草靈的敏感度不同，表明這些地區野燕麥對精噁唑禾草靈產生了不同程度的抗藥性。對5個高水平抗性種群HLWY、HZXP、HZXH、HXGT、ZMSX和1個敏感種群HXZC進行靶標基因序列檢測，均未發現與之前報道的6個ACCase特定位點的突變，野燕麥的抗藥性機制有待繼續研究。

關鍵詞：野燕麥；抗藥性；精噁唑禾草靈；生物測定；乙酰輔酶A羧化酶

中圖分類號：S476? 文獻標志碼：A? 文章編號：1003-935X（2023）04-0037-07

Susceptibility of Avena fatua to Fenoxaprop-P-Ethyl and Sequence Analysis of Its ACCase Gene

WANG Xiang- yu1，HAO Qiao- qiao1，YUAN Xin- yang1，LIU Run- qiang1，WANG Hong- liang1，ZHANG Pei1，2

（1.School of Resources and Environment，Henan Institute of Science and Technology/Henan EngineeringResearch Center of Biological Pesticide & Fertilizer Development and Synergistic Application，Xinxiang 453003，China；2.Henan Postdoctoral Innovation Practice Base，Xinxiang 453003，China）

Abstract：This study aimed to clarify the fenoxaprop-P-ethyl-resistance level of Avena fatua and the target resistance mechanism of ACCase in resistant populations，determined susceptibility level of 30 A. fatua populations in different regions of Henan Province by whole plant bioassay，and amplified and sequenced the target ACCase gene fragments of resistant A. fatua populations. The final study showed that 5 tested populations had a high level of fenoxaprop-P-ethyl-resistance，11 had a medium level of resistance，11 had a low level of resistance，and 3 were sensitive populations. Among them，the population with the highest herbicide-resistance was HZXH. While the whole plant biological method was used to determine，the effective inhibition medium dose （ED50） of fenoxaprop-P-ethyl to this population was 143.66 g a. i./hm2，and the relative resistance multiple was 21.31. The sensitivity of A. fatua in different regions of Henan Province to fenoxaprop-P-ethyl is different，which indicated that A. fatua in these regions had different degrees of resistance to fenoxaprop-P-ethyl. The target gene sequences of five highly resistant populations including HLWY，HZXP，HZXH，HXGT and ZMSX and one sensitive population of HXZC were detected，but no mutation was found at the six ACCase specific loci reported previously. And the mechanism of herbicide-resistance of A. fatua needs to be further studied.

Key words：Avena fatua；herbicide-resistance；fenoxaprop-P-ethyl；bioassay；ACCase

野燕麥（Avena fatua L.）是禾本科燕麥屬的一年生草本植物，在中國南北各地均有分布，主要危害小麥、油菜等作物［1］。野燕麥是中國15 種惡性雜草之一，在中國冬麥區危害率達15.6%，春麥區危害率達25.3%，全國嚴重危害面積約為160萬hm2，造成小麥減產17.5億kg/年［2］?；瘜W除草劑在農業生產中起著非常重要的作用，雖然起步晚于殺蟲劑和殺菌劑，但發展極其迅速［3］。精噁唑禾草靈（fenoxaprop-P-ethyl）是乙酰輔酶A 羧化酶（ACCase ）抑制劑［4］，具有活性高、殺草譜廣和選擇性強等優點，20世紀70年代后期在我國小麥田和油菜田開始使用，到20世紀90年代已成為我國油菜田防除一年生禾本科雜草的主要藥劑。該除草劑的作用位點單一，所以容易產生抗藥性［5］。目前，國內外對野燕麥的研究主要集中在生態適應性、遺傳多樣性、危害度調查和化學防除藥劑的篩選以及對精噁唑禾草靈抗性水平及抗性機制研究方面。如李濤等對野燕麥種子的萌發特性以及防除藥劑進行了研究，發現25 ℃為野燕麥的最適發芽溫度，炔草酯和唑啉草酯的防效最高［6］；李巖等的研究表明，安徽省14個地市不同野燕麥群體之間有遺傳多樣性［7］；李鵬對野燕麥的靶標抗性機制進行了研究，但并沒有發現特定位點發生突變［8］。雖然已有野燕麥對精噁唑禾草靈的抗藥性的相關報道，但由于不同地區不同年份用藥的差異，野燕麥對精噁唑禾草靈的抗藥性也不同。為了明確河南省野燕麥對精噁唑禾草靈的抗藥性水平及靶標抗性機制，試驗采用整株生物測定法測定野燕麥的敏感性水平，并從分子層面明確野燕麥的ACCase基因序列，以期為麥田抗性雜草的治理及延緩抗藥性雜草的發生提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試種子和藥劑

本試驗所使用的野燕麥種子均來自河南省不同地區，采集的種子均為成熟有活力種子（表1）。供試除草劑為69 g/L精[XCY1.tif，JZ]唑禾草靈水乳劑，由中國農業科學院植物保護所北京中保綠農科技集團有限公司生產。

1.1.2 主要儀器

PCR儀［耶拿分析儀器（北京）有限公司］、電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、電子天平（上海眾淵實業有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）、渦旋振蕩儀［艾卡（廣州）儀器設備有限公司］、GTR16-2型高速冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）、ASS-4 型自動控制農藥噴灑系統（北京盛恒天寶科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試種子信息

2018—2021年所采集的野燕麥種子信息見表1。

1.2.2 野燕麥對精噁唑禾草靈的敏感度測定方法

整株生物測定參照Feng等的方法［9］，并稍作修改。將營養土（有機質含量為1.4%，pH值為5.6）和田園土按體積比1 ∶1混合，然后裝入帶有孔底的塑料盆（口徑7 cm、底徑5 cm、高8 cm）中，隨即播種已經解除休眠的野燕麥種子，每個種群種28盆，每盆播種20個種子。置于室溫中培養，白天溫度為20 ℃，晚上15 ℃，每天光照12 h，正常水肥管理。

待野燕麥植株生長到1～2葉期時定苗，留20株/盆，繼續培養至2～3葉期，采用北京盛恒天寶科技有限公司生產的 ASS-4 型自動定量噴霧系統（扇形噴頭型號為TEEJET-9503EVS，噴霧塔為ASS-4型）進行莖葉噴霧處理。設定噴霧壓力為 0.275 MPa，噴液量為 450 L/hm2，噴液速度為 1.2 L/min，噴頭與植株之間的距離50 cm。根據預試驗確定各種群處理劑量，本試驗采用6個處理，分別為3.9、15.5、31.0、62.0、124.0、248.0 g a.i./hm2，每個處理4盆。另設清水作為空白對照（CK），在處理21 d后測定地上部莖葉的鮮重，計算每個野燕麥種群的鮮重抑制率，同時將藥劑處理后存活的單株葉片留存，每個處理重復4次共28盆，整體重復2次。

1.2.3 野燕麥的ACCase基因克隆及序列分析

待野燕麥生長到3～4葉期，剪取100 mg葉片，放入研缽中加入液氮研磨，提取方法根據DNA Quick Plant System［非離心柱型，天根生化科技（北京）有限公司］說明書進行。根據NCBI上已公布的與野燕麥同源性較高的大穗看麥娘（Alopecurus myosuroides）的ACCase 基因序列（登錄號：AJ310767）設計1對引物［8］：

正向引物，3′-CTGAATGAAGAAGACTATGGTCG[JP+1]-5′；反向引物3′-[JP9]TCCTCTGACCTGAACTTGATCTC[JP]-5′。

PCR擴增目的基因長度為1 050 bp，退火溫度為55 ℃，包括1 781～2 088氨基酸突變位點。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成。反應體系為25 μL，參數為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環；72 ℃ 10 min，電泳驗證結果，完成后將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序所得序列在 NCBI 上進行 BLAST 比對，用BioEdit軟件對擴增出的抗性與敏感野燕麥種群的ACCase基因序列進行比對，分析是否發生特定位點氨基酸突變。每個種群檢測10株植株。

1.2.4 數據處理及抗性分級

使用R軟件“drc”程序包中drm函數的W 1.4非線性擬合方程統計分析，導入原始數據計算出抑制中劑量（ED50）值［10］。根據每個野燕麥種群的ED50值，計算不同野燕麥種群的相對抗性倍數［11］。ED50值的計算公式：

f［x，（b，c，d，e）］=c+d-c1+exp［b（lgx-lge）］。（1）

式中：x表示鮮重抑制率；e表示ED50值；c和d分別代表置信區間的下限和上限；b代表e附近的相關斜率。

相對抗性倍數（RI）=抗性種群的ED50值/敏感種群ED50 值。（2）

參考 Beckie等的方法［12］，將相對抗性倍數分為 4 個等級：RI＜2 表示敏感或不抗種群（S），2≤RI＜5 表示低水平抗性種群（L），5≤RI≤10 表示中水平抗性種群（M），RI＞10表示高水平抗性種群（H）。

2 結果與分析

2.1 不同野燕麥種群對精噁唑禾草靈的敏感性[HT]

采用整株生物測定法測定30個不同野燕麥種群對精噁唑禾草靈的敏感性，結果見表2。其中，河南省大部分地區的野燕麥種群對精噁唑禾草靈產生了抗藥性，有5個種群對精噁唑禾草靈產生了高水平抗性，11個種群產生了中水平抗性，11個種群產生了低水平抗性，3個為敏感種群。HZXH野燕麥種群對精噁唑禾草靈抗性水平最高，其ED50值為143.66 g a.i./hm2；HLWY、ZMSX、HZXP、HXGT野燕麥種群次之，ED50值分別為100.09、92.21、84.26、75.39 g a.i./hm2，它們的相對抗性倍數均大于10，為高水平抗性種群；HXZC、HPYT、HKQX種群對精噁唑禾草靈的ED50值為6.74、7.89、7.26 g a.i./hm2，相對抗性倍數在1.0～2.0之間，為敏感種群；?其他種群的相對抗性倍數在 2.0～10.0之間?？剐苑N群占比90%，可見抗性野燕麥的發生情況嚴重。

2.2 抗精噁唑禾草靈野燕麥種群ACCase基因序列分析

對HLWY、HZXP、HZXH、HXGT、ZMSX等5個高水平抗性野燕麥種群和HXZC敏感種群的ACCase基因序列進行靶標基因測序，用BioEdit進行多序列比對，查找野燕麥對精噁唑禾草靈ACCase抑制劑類除草劑抗性的相關基因位點，Yu等曾經報道過野燕麥對精噁唑禾草靈的抗藥性與ACCase相關的突變位點有以下6個：1 781、1 999、2 027、2 041、2 078、2 088［13-14］。分析多序列比對結果（表3），均未在已報道的引起野燕麥抗藥性的氨基酸突變位點發生突變。

3 討論與結論

麥田野燕麥對除草劑產生抗性已有過報道。周志恒等研究發現，野燕麥已對精噁唑禾草靈和甲基二磺隆產生抗性，同時也對炔草酯、唑啉草酯、烯禾啶等產生交互抗性［15］。呂曉輝調查發現，西北地區野燕麥已對高效氟吡甲禾靈產生抗性［16］。郭峰等采用整株生物測定與種子生物測定檢測了河南、湖北、江蘇3個省份共11個野燕麥種群對精噁唑禾草靈和炔草酯的敏感性，發現金水閘野燕麥種群對精噁唑禾草靈和炔草酯敏感性最高［17］。本試驗通過整株生物測定法確認了河南省野燕麥對精噁唑禾草靈的抗藥性水平，其中HZXH、HLWY、ZMSX、HZXP、HXGT等野燕麥種群抗藥性最高，相對抗性倍數分別為21.31、14.85、13.68、12.50、11.19。調查發現，這些地塊連年施用精噁唑禾草靈，導致藥劑對野燕麥的防效降低，這可能是野燕麥對精噁唑禾草靈產生高抗藥性的原因。

精噁唑禾草靈是一種乙酰輔酶A 羧化酶（accase）抑制劑類除草劑，通過影響植株的正常生長發育，毀壞細胞構造，出現細胞毒素，從而達到除草的目的［18-19］，因其作用靶標單一，長期使用藥效降低，藥量增加，使雜草產生抗藥性［20］。雜草對除草劑的抗性包括靶標抗性和非靶標抗性，靶標抗性是指植物體內靶標酶發生突變產生抗性［21］，其中靶標基因突變、靶標酶敏感性降低、靶標基因表達量上升等是雜草產生靶標抗性機制的重要原因［22］。趙寧等的研究表明，日本看麥娘ACCase基因第1 781位由異亮氨酸 （Ile） 突變為亮氨酸 （Leu），使日本看麥娘產生了靶標抗性［23］；Kaundun研究發現，多花黑麥草中ACCase CT區天冬氨酸（Asp） 2 078被甘氨酸（Gly）取代，導致其對禾草靈、烯禾啶和唑啉草酯產生抗藥性［24］；非靶標抗性包括解毒代謝、氧化代謝、屏蔽作用或者隔離作用等增強，其中解毒代謝是最常見的非靶標抗性機制［25-26］。Kaundun等在抗性黑草種群中就發現，非靶標抗性是導致其對炔草酯和唑啉草酯產生抗性的主要原因［27］；Neve等在原本敏感的多花黑麥草種群中，用低劑量高效氟吡甲禾靈進行篩選，僅僅經歷3代后就使該種群對高效氟吡甲禾靈產生了代謝抗性［28］。本試驗以抗性野燕麥生物型為研究材料，研究野燕麥抗藥性的產生是否是由乙酰輔酶A羧化酶的基因序列發生突變所致，結果表明，這5個高抗性野燕麥種群均未在特定氨基酸突變位點發生突變，說明野燕麥產生抗性的機制不是由靶標基因突變引起的，可能是靶標酶活性降低或者靶標基因過量表達引起的靶標抗性，也可能是解毒代謝引起的非靶標抗性，其抗性機制有待進一步研究。

雜草對除草劑產生抗性已成為麥田作物草害治理的重大難題之一，為了有效控制雜草的危害、延緩抗藥性的發展，對野燕麥的防除采用綜合防治的策略，同時做到科學用藥，并選用不同作用機制的除草劑交替使用［29］。

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基金項目：河南省科技攻關項目（編號：222102110074）；河南科技學院高層次人才引進項目（編號：2018024）。

作者簡介：王祥宇，男，碩士研究生，主要從事農藥學研究。E-mail：360838299@qq.com。

通信作者：張 佩，博士，講師，主要從事農藥學研究。E-mail：zhangpei0519@126.com。