基于TCGA等數據庫分析TMEM88在肝細胞中的表達水平及其與預后的關系

Andrew Liman，朱 倩

武漢中南醫院肝膽胰外科（武漢 430071）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統最常見和最致命的惡性腫瘤之一，在世界范圍內造成了巨大的經濟和健康負擔，特別是在南亞和其他低收入國家[1-2]。雖然在過去10 年中免疫治療和靶向分子治療的進展改善了HCC 的治療，但患者的五年總體存活率仍不到20%[3-4]。HCC 患者存活率低主要是由于早期HCC發現率低，術后早期復發所致[5]。盡管近年來已經發現了有關肝癌診斷和預后的生物標志物，但其較低的敏感性和特異性限制了臨床應用[6-7]。因此，迫切需要尋找新的診斷和預后分子標志物及其相關的分子機制和信號通路，以改善HCC 患者的預后。

跨膜蛋白88（transmembrane protein 88，TMEM88）是一種新發現的跨膜蛋白，在胚胎發育過程中與disheveled-1 蛋白相互作用[8]。已有研究證明TMEM88 是Wnt/β-catenin 信號傳導的關鍵調節因子，在調節胚胎心肌細胞分化和心臟發育中發揮重要作用[9]。TMEM88 的失調與多種病理過程有關，包括瘢痕組織的形成、炎癥和肝纖維化等[10-12]。它也作為癌基因或腫瘤抑制因子發揮作用[13]。TMEM88 表達在肺癌和乳腺癌中升高，這與晚期腫瘤分期、淋巴結轉移和較差的總生存率相關[14-15]。此外，TMEM88 的高表達增強了癌細胞在體外的侵襲和轉移[14-15]，相比之下，由于其啟動子的低甲基化，TMEM88 在非小細胞肺癌中的表達較低，其高表達限制了癌細胞的增殖和侵襲[16]。這些發現表明TMEM88 在癌癥中的重要作用，但其在正常肝細胞和肝腫瘤細胞中的表達模式及其與HCC 患者預后的關系尚不明確。因此，本研究主要探究TMEM88 在HCC 中的表達水平及其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 數據來源

本研究中的所有數據均來自公共數據庫癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）和基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。本研究基于公開數據庫，不存在倫理問題或其他利益沖突。TCGA 由美國癌癥研究所和國家人類基因組研究所資助，包括超過20 000 種原發性癌癥的分子特征數據和超33 種癌癥類型的匹配正常樣本，產生了超過2.5 PB 的基因組、表觀基因組、轉錄組和蛋白質組數據。GEO 是一個國際公共資料庫，用于存檔和免費分發微陣列、下一代測序和研究界提交的其他形式的高通量功能基因組學數據。GEO 的三個主要目標是：①提供一個強大的、多功能的數據庫，可以在其中有效地存儲高通量功能基因組數據；②提供簡單的提交程序和格式，以支持來自研究社區的完整且注釋良好的數據存儲；③提供用戶友好的機制，允許用戶查詢、定位、審查和下載感興趣的研究和基因表達譜。

Kaplan-Meier（http://kmplot.com/analysis/）生存曲線分析平臺用來分析TMEM88 基因表達與基于風險比（hazard ratios，HR）和對數秩P 值[17]。

腫瘤免疫估計資源數據庫（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）用于使用來自TCGA 數據庫的10 000 多個樣本系統分析32 種癌癥類型中的腫瘤浸潤免疫細胞（TIIC）[18]。TIMER 根據基因表達譜的統計分析確定腫瘤浸潤免疫細胞的豐度[19]。本文分析了TMEM88 基因表達水平與浸潤免疫細胞豐度之間的關聯，包括CD4+ T 細胞、CD8+ T細胞、B 細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞基于特定標記基因在包括HCC 在內的不同癌癥中的表達。用于分析腫瘤浸潤性免疫細胞的標記基因，包括T 細胞、B 細胞、TAM、單核細胞、M1 巨噬細胞、M2 巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞（DC）、T 輔助（Th）細胞、T 輔助17（Th17）細胞、濾泡輔助T（Tfh）細胞、耗盡的T 細胞和Tregs 均基于先前研究的數據[20-21]。TMEM88 基因位于x 軸上，相關標記基因位于y 軸。

基因表達譜交互分析（gene expression profiling enrichment analysis，GEPIA）數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）用于分析來自TCGA 和GTEx 項目的8 587 個正常和9 736 個腫瘤組織樣本的RNA 測序表達數據[22]。

UALCAN 是一個全面的、用戶友好的、交互式的網絡資源，用于分析癌癥OMICS 數據。它基于Perl-CGI 構建，使用高質量的圖形、javascrip技術和css。UALCAN 的設計目的是：①提供公開的癌癥OMICS 數據（TCGA、MET500、CPTAC和CBTTC）；②允許用戶識別生物標志物或對潛在的感興趣基因進行電子驗證；③提供描繪蛋白質編碼、miRNA 編碼和lincRNA 編碼基因的表達譜、患者生存信息的圖表和曲線圖；④評估啟動子甲基化對基因表達的表觀遺傳調節；⑤進行泛癌基因表達分析；⑥通過鏈接檢索到HPRD、GeneCards、Pubmed、TargetScan、人類蛋白質圖譜、DrugBank、Open Target 和GTEx 提供有關選定基因/靶點的更多信息。這些資源使研究人員能夠收集其感興趣的基因/靶點的有價值的信息和數據；⑦提供臨床蛋白質組聯盟數據分析，包括總/磷酸蛋白質；⑧提供兒童腦腫瘤基因表達和蛋白質表達分析[23-24]。

STRING 是已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫。相互作用包括直接（物理）和間接（功能）聯系；它們源于計算預測、生物體之間的知識轉移以及從其他（主要）數據庫匯總的相互作用。STRING 中的數據相互作用主要來自：基因組上下文預測、高通量實驗室實驗、（保守的）共表達、自動文本挖掘和數據庫中的先前知識。STRING 數據庫目前涵蓋來自5 090 個生物體的24 584 628 個蛋白質[25]。

cBioPortal 是一個開放訪問、開放源碼的資源，用于交互式探索多維癌癥基因組數據集。cBioPortal 的目標是通過提供對大規模癌癥基因組學項目的分子圖譜和臨床屬性的快速、直觀和高質量的訪問，顯著降低復雜基因組數據和癌癥研究人員之間的障礙，從而使研究人員能夠將這些豐富的數據集轉化為生物學見解和臨床應用[26-27]。

1.2 研究方法

1.2.1 TMEM88在不同癌癥中的表達情況

使用TIMER 數據庫分析TCGA 數據庫中不同腫瘤類型中TMEM88 的表達水平。使用cBioPortal 工具研究不同腫瘤類型中TMEM88 的遺傳變異情況。

1.2.2 TMEM88在肝臟組織中的表達情況

使用CPTAC 數據庫分析TCGA 數據庫中TMEM88 在肝臟正常組織與肝臟腫瘤組織中的表達情況。使用STRING 工具研究肝臟組織中與TMEM88 表達相關的基因。使用GEPIA 工具分析TMEM88 基因在不同HCC 病理分期中的表達情況，分析DVL1、DVL2、DVL3 和VRK2 與TMEM88表達相關性和分析TMEM88 與免疫細胞標記基因的相關性。利用TIMER 數據庫分析TMEM88 與DVL1、DVL2、DVL3 和VRK2 的 相關性，分 析TMEM88 表達與 HCC 組織中免疫細胞、成纖維細胞浸潤水平的相關性；使用UALCAN 工具分析TMEM88 在肝臟正常組織與肝臟腫瘤組織不同臨床病理因素中的磷酸化水平的變化。

1.2.3 TMEM88的表達情況與患者預后的關系

使用Kaplan-Meier 繪圖儀數據庫分析HCC中高和低TMEM88 表達的預后生存曲線，分析HCC 患者不同臨床病理因素中TMEM88 mRNA 表達與患者預后的相關性。

2 結果

2.1 TMEM88 mRNA的表達情況分析

使用TIMER 數據庫對TCGA RNA-seq 數據進行分析表明，TMEM88 mRNA 在肝臟腫瘤組織中的表達高于相對應的正常組織（圖1-a）。使用GEPIA 數據分析時也得到相同的結果，且差異有統計學意義（P＜0.001）（圖1-b）。繼續使用GEPIA 數據分析TCGA 數據庫中TMEM88 在肝臟腫瘤不同病理分期（I 期、II 期、III 期和IV期）中的表達情況，結果顯示在各個分期的表達情況跟正常肝臟組織的表達水平差異有統計學意義（P=0.003）（圖1-c）。使用cBioPortal 工具研究不同腫瘤類型中TMEM88 的遺傳變異情況，結果顯示在肝臟腫瘤組織中TMEM88 以深度缺失的形式影響肝臟組織的正常遺傳功能，異變或擴增的遺傳變異情況并沒有在肝臟腫瘤組織中被檢測到（圖1-d）。

圖1 TMEM88在肝臟組織中的表達情況Figure 1. Expression of TMEM88 in liver tissue

利用STRING 工具分析在肝臟組織中和TMEM88 表達相關的基因，得到DVL1、DVL2、DVL3 和VRK2 共4 個基因（圖1-e）。進一步使用TIMER 數據庫分析TMEM88 與這幾個基因在肝臟組織表達之間的潛在關系，發現其與DVL1 的關系無統計學意義（P＞0.05），與DVL2、DVL3和VRK2 均呈負相關（圖2-a）。但在使用GEPIA分析這幾個基因與TMEM88 表達的相關性時發現只有與VRK2 的負相關性有統計學意義（R=-0.14；P=0.005），與DVL2（P=0.26）和DVL3（P=0.37）的相關性均無統計學意義（圖2-b）。

圖2 TMEM88與相關基因在肝癌組織中的相關性Figure 2. Correlation between TMEM88 and related genes in hepatocellular carcinoma

2.2 TMEM88表達與HCC組織中免疫細胞浸潤水平的相關性

本研究使用來自TIMER 數據庫中371 例HCC 患者的數據來研究TMEM88 表達與HCC 組織中免疫細胞浸潤水平的相關性。HCC 組織中的TMEM88 表達與CD8+ T 細胞的浸潤水平呈正相關（partial.cor=0.004），但沒有統計學意義（P=0.94)。與腫瘤純度（partial.cor=-0.178；P＜0.001）、B細胞（partial.cor=-0.207；P＜0.001）、巨噬細胞（partial.cor=-0.2；P＜0.001）和中性粒細胞（partial.cor=-0.145；P=0.007）的浸潤水平呈負相關且均有統計學意義。雖然與CD4+T 細胞（partial.cor=-0.065）和樹突細胞（partial.cor=-0.05）的浸潤水平呈負相關，但均沒有統計學意義（圖3-a）。

圖3 TMEM88 表達與肝癌組織中免疫細胞浸潤水平的相關性Figure 3. Correlation between TMEM88 expression and immune infiltration in hepatocellular carcinoma

此外，TMEM88 在HCC組織中的表達與患者生存結果顯著相關，HCC 患者中較高的TMEM88 表達與更好的預后相關。B 細胞（P=0.489）、CD8+ 細胞（P=0.551）、CD4+ 細胞（P=0.454）、巨噬細胞（P=0.153）、中性粒細胞（P=0.2）和樹突細胞（P=0.288）標志物的表達水平與患者生存結果無明顯相關性（圖3-b）。

使用TIMER 數據庫分析TMEM88 基因的表達水平與不同腫瘤組織中的成纖維細胞浸潤水平之間的潛在相關性（圖3-c）。結果顯示，TMEM88在肝臟腫瘤細胞中的MCPCOUNTER 浸潤情況（P=0.007）、XCELL 浸潤情況（P＜0.001）及TIDE 浸潤情況（P＜0.001）均呈正相關且均有統計學意義，而EPIC 浸潤情況幾乎為零（圖3-d）。

2.3 TMEM88在HCC中的表達情況

使用Kaplan-Meier 生存曲線分析平臺分析了TMEM88 表達在各種人類癌癥中的預后價值。高TMEM88 表達與HCC 隊列中更好的總生存期（OS）、無進展生存期（PFS）、無復發生存期（RFS）和疾病特異性生存期（DSS）相關。TMEM88 低表達與HCC 預后較差相關，其中OS[HR=0.58，95%CI（0.41，0.82），P＜0.005]、PFS[HR=0.59，95%CI（0.44，0.8），P＜0.005]、RFS[HR=0.69，95%CI（0.49，0.96），P=0.026]、DSS[HR=0.49，95%CI（0.31，0.78），P=0.49]。雖然HCC 中的TMEM88 mRNA 表達高于相應的正常組織，但高TMEM88 表達與HCC 的更好預后相關（圖4）。

圖4 肝癌患者TMEM88 表達的預后生存曲線Figure 4. Prognostic survival curve of TMEM88 expression in liver cancer patients

使用UALCAN 工具分析TMEM88 在肝臟正常組織與肝臟腫瘤組織不同臨床病理因素中的磷酸化水平的變化，結果顯示在肝臟正常組織中的TMEM88 磷酸化水平與肝臟腫瘤中無論是平均值還是數值范圍均有明顯的差異。在分析HCC 患者不同臨床病理分期因素中，共收錄了50 個正常肝臟組織、168 個I 期肝癌組織、84 個II 期肝癌組織、82 個肝癌組織和6 個IV 期肝癌組織。結果顯示，正常肝臟組織與I 期肝癌組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與II 期肝癌組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與III 期肝癌組織（P＜0.001）、

正常肝臟組織與IV 期肝癌組織（P=0.012）和I期肝癌組織與II 期肝癌組織（P=0.050）的數值差異均有統計學意義。而在I 期肝癌組織與III 期肝癌組織（P=0.171）、I 期肝癌組織與IV 期肝癌組織（P=0.439）、II 期肝癌組織與III 期肝癌組織（P=0.755）、II 期肝癌組織與IV 期肝癌組織（P=0.899）和III 期肝癌組織與IV 期肝癌組織（P=0.828）的數值差異均無統計學意義（圖5-a）。

圖5 不同臨床病理因素中TMEM88的磷酸化水平Figure 5. Phosphorylation levels of TMEM88 in different clinicopathological factors

TMEM88 表達水平與病人種族有密切關系。共收錄了50 個正常肝臟組織、177 個白種人HCC患者組織、17 個非裔美籍HCC 患者組織和157個亞裔HCC 患者組織。結果顯示，正常肝臟組織與白種人患者組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與非裔美籍患者組織（P=0.012）、正常肝臟組織與亞裔患者組織（P＜0.001）和白種人患者組織與亞裔患者組織（P=0.008）的數值差異均有統計學意義。而白種人患者組織與非裔美籍患者組織（P=0.577）和非裔美籍組織與亞裔患者組織（P=0.526）的數值差異均無統計學意義（圖5-b）。

對50 個正常肝臟組織、245 個男性患者組織和117 個女性患者組織分析，結果顯示，正常肝臟組織與男性患者組織（P＜0.001）和正常肝臟組織與女性患者組織（P＜0.001）的數值差異均有統計學意義。而男性患者組織與女性患者組織（P=0.68）的數值差異無統計學意義（圖5-c）。

80 歲以下HCC 患者組織中都檢測到高TMEM88 表達水平。共收錄了50 個正常肝臟組織、27 個21 至40 歲患者的組織、140 個41 歲至60 歲患者的組織、181 個61 歲 至80 歲 患者的組織和10 個大于80 歲患者的組織。結果顯示，正常肝臟組織與21 歲至40 歲患者組織（P=0.001）、正常肝臟組織與41 歲至60 歲患者組織（P＜0.001）和正常肝臟組織與61 歲至80歲患者組織（P＜0.001）的數值差異均有統計學意義。而正常肝臟組織與大于80 歲患者組織（P=0.091）、21 歲至40 歲患者組織與41 歲至60 歲患者組織（P=0.178）、21 歲至40 歲患者組織與61 歲至80 歲患者組織（P=0.277）、21 歲至40 歲患者組織與大于80 歲患者組織（P=0.61）、41 歲至60 歲患者組織與61 歲至80 歲患者組織（P=0.224）、41 歲至60 歲患者組織與大于80歲患者組織（P=0.309）和61 歲至80 歲患者組織與大于80 歲患者組織（P=0.388）的數值差異均無統計學意義（圖5-d）。

TMEM88 表達水平與患者體重不呈正相關。共收錄了50 個正常肝臟組織、154 個正常體重患者組織（18.5 ≤BMI ＜25）、88 個超重患者組織（25≤BMI＜30）、57個肥胖患者組織（30≤BMI＜40）和11 個極度肥胖患者組織（BMI ≥40）。結果顯示，正常肝臟組織與正常體重患者組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與超重患者組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與肥胖患者組織（P＜0.001）和正常肝臟組織與極度肥胖患者組織（P=0.019）的數值差異均有統計學意義。而正常體重患者組織與超重患者組織（P=0.52）、正常體重患者組織與肥胖患者組織（P=0.427）、正常體重患者組織與極度肥胖患者組織（P=0.694）、超重患者組織與肥胖患者組織（P=0.947）、超重患者組織與極度肥胖患者組織（P=0.985）和肥胖患者組織與極度肥胖患者組織（P=0.985）的數值差異均無統計學意義（圖5-e）。

在分析與患者肝癌評級的因素中，共收錄了50 個正常肝臟組織、54 個1 級患者組織（分化良好，低等級）、173 個2 級患者組織（中度分化，中等級）、118 個3 級患者（低分化，高等級）和12 個4 級患者（未分化，高等級）。結果顯示正常肝臟組織與1 級患者組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與2 級患者組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與3 級患者組織（P＜0.001）、1 級患者組織與3 級患者組織（P=0.022）、1級患者組織與4 級患者組織（P=0.009）和2 級患者組織與4 級患者組織（P=0.009）的數值差異均有統計學意義。而正常肝臟組織與4 級患者組織（P=0.126）、1 級患者組織與2 級患者組織（P=0.304）、2 級患者組織與3 級患者組織（P=0.090）和3 級患者組織與4 級患者組織（P=0.099）的數值差異均無統計學意義（圖5-f）。

無淋巴結轉移患者組織中的TMEM88 表達水平數據差異有統計學意義。共收錄了50 個正常肝臟組織、252 個N0 患者組織（無區域淋巴結轉移）和4 個N1 患者組織（1 至3 個腋窩淋巴結轉移）。結果顯示，正常肝臟組織與N0 患者組織（P＜0.001）的數值差異有統計學意義。而正常肝臟組織與N1 患者組織（P=0.43）和N0 患者組織與N1 患者組織（P=0.934）的數值差異均無統計學意義（圖5-g）。

無論是否有TP53 突變，患者組織中TMEM88均為高表達。共收錄了50 個正常肝臟組織、105個有TP53 突變的組織和255 個沒有TP53 突變的組織。結果顯示，正常肝臟組織與有TP53 突變的組織（P＜0.001）、正常肝臟組織與沒有TP53 突變的組織（P＜0.001）和有TP53 突變與沒有TP53 突變組織（P＜0.001）的數值差異均有統計學意義（圖5-h）。

在分析與肝癌亞型的因素中，共收錄了50個正常肝臟組織、361 個HCC 患者組織，3 個肝臟纖維板層癌（fibrolamellar hepatocellular carcinoma，FL-HCC）患者組織和 7個混合肝膽管癌（hepatocholangiocarcinoma，HCC-CC）患者組織。結果顯示，正常肝臟組織與HCC 患者組織（P＜0.001）和HCC 患者組織與FLHCC 患者組織（P=0.012）的數值差異均有統計學意義。而正常肝臟組織與FL-HCC 患者組織（P=0.108）、正常肝臟組織與混合HCC-CC 患者組 織（P=0.179）、HCC 與混合HCC-CC 患者組織（P=0.266）和FL-HCC 患者組織與混合HCC-CC 患者組織（P=0.207）的數值差異均無統計學意義（圖5-i）。

2.4 臨床病理因素與患者預后的相關性

使用Kaplan-Meier生存曲線分析平臺分析了TMEM88表達與HCC不同臨床特征之間的關系，結果如表1所示。低TMEM88表達與男性（OS：HR=0.58，P=0.0160；PFS：HR=0.65，P=0.0173）、HCC2級患者（OS：HR=0.53，P=0.0150；PFS：HR=0.61，P=0.0234）、3級患者（OS：HR=0.39，P=0.0030；PFS：HR=0.55，P=0.0172）、黃種人患者（OS：HR=0.43，P=0.0059；PFS：HR=0.60，P=0.0346）和不酗酒的患者（OS：HR=0.50，P=0.0037；PFS：HR=0.66，P=0.0456）較差的OS、PFS相關。低TMEM88mRNA表達與女性（HR=0.44，P=0.0050）、2+3期患者（HR=0.49，P=0.0032）、3期患者（HR=0.44，P=0.0064）、3+4期患者（HR=0.50，P=0.0158）、AJCC_T2級患者（HR=0.47，P=0.0466）、AJCC_T3級患者（HR=0.47，P=0.0123）和微血管侵犯患者（HR=0.46，P=0.0452）較差的OS相關。TMEM88mRNA低表達與1期患者（HR=0.58，P=0.0313）、1+2期患者（HR=0.57，P=0.0036）、白種人患者（HR=0.65，P=0.0325）、有酗酒的患者（HR=0.60，P=0.0088）、肝炎病毒患者（HR=0.63，P=0.0459）和無肝炎病毒患者（HR=0.63，P=0.0369）的PFS較差相關。然而，TMEM88表達與2期患者（OS：HR=0.59，P=0.1886；PFS：HR=0.65，P=0.1561）和1級患者（OS：HR=0.59，P=0.2734）；PFS：HR=0.72，P=0.4078）或AJCC_T1級患者（OS：HR=0.79，P=0.4186；PFS：HR=0.62，P=0.0557）的OS或PFS無關。

2.5 TMEM88 mRNA水平與免疫細胞不同亞群標志物的相關性

使用GEPIA 數據庫根據HCC 組織中的免疫標記基因的表達水平，研究TMEM88 表達與II型T 細胞狀態之間的相關性。在HCC 組織中分析的免疫細胞包括單核細胞、中性粒細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、T 輔助細胞1（Th1）、T 輔助細胞2（Th2）、調節性T（Tregs）和耗竭性T 細胞。GEPIA 數據庫分析顯示，HCC 組織中TMEM88 的表達與腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、中性粒細胞、T 輔助細胞、Tregs 和耗竭性T 細胞的標記基因表達顯著相關（表2）。

具體而言，TMEM88 表達與特定免疫細胞標志物如單核細胞標志物CD86（正常：r=0.57，P＜0.001）和CD11b（腫瘤：r=-0.23，P＜0.001；正常：r=0.43，P=0.0019）；中性粒細胞標志物CCR7 （ 腫 瘤：r=0.15，P=0.0035； 正 常：r=0.49，P＜0.001）；腫瘤相關巨噬細胞標志物CD68（正常：r=0.48，P≤0.001）；T 輔助細胞1 標志物IFN-γ（腫瘤：r=-0.14，P=0.0064；正常：99r=0.33，P=0.02），STAT1（腫瘤：r=-0.17，P=0.0012；正常：r=0.45，P＜0.001），T-bet（腫瘤：r=0.17，P＜0.001，正常：r= 0.48，P＜0.001）和TNF-α（腫瘤：r=-0.11，P=0.031，正常：r=0.3，P=0.034)；T 輔助細胞2 標志物STAT6（正常：r=0.48，P＜0.001）；調節性T 細胞標志物CCR8（腫瘤：r=-0.12，P=0.018）和TGF-β（正常：r=0.7，P＜0.001）；耗竭性T 細胞CTLA4（腫瘤：r=-0.2，P＜0.001，正常：r=0.43，P=0.0016），PD-1（PDCD1）（腫瘤：r=-0.13，P=0.016；正常：r=0.46，P＜0.001）和TIM-3（HAVCR2）（腫瘤：r=-0.18，P＜0.001；正常：r=0.57，P＜0.001）有密切的相關性。

3 討論

本次研究使用TIMER 數據庫中對癌組織和正常組織中TMEM88 mRNA 水平的分析表明，TMEM88 在大多數癌組織中的表達顯著低于相應的正常組織，但在HCC 組織中的表達顯著高于相應的正常組織。然而，TMEM88 在不同類型癌癥中的表達存在差異，這可能反映了數據收集方法和潛在致病機制的差異。雖然如此，TMEM88在HCC 組織中的表達水平在不同的數據庫中是一致的。使用GEPIA 數據研究TMEM88 在肝臟腫瘤不同病理分期中的表達情況的分析表明，TMEM88 的表達貫穿所有分期，且跟正常肝臟組織的表達水平差異明顯。使用cBioPortal 工具研究不同腫瘤類型中TMEM88 的遺傳變異情況的分析表明，TMEM88 以完全深度缺失的形式影響肝臟組織的正常遺傳功能，在肝臟腫瘤組織中未檢測到任何異變或擴增的遺傳變異情況。在使用STRING 工具分析肝臟組織中和TMEM88 表達相關的基因，得到DVL1、DVL2、DVL3 和VRK2四個基因，但進一步使用TIMER 數據庫分析在肝臟組織表達之間的潛在關系時發現其與DVL2、DVL3 和VRK2 均呈負相關。使用GEPIA 分析這幾個基因與TMEM88 表達的相關性時發現只有與VRK2 的負相關性有意義。TMEM88 在肝臟腫瘤細胞中的MCPCOUNTER 浸潤情況、XCELL浸潤情況及TIDE 浸潤情況均呈正相關，說明了TMEM88 在HCC 組織中有促進免疫逃逸的功能。

除此之外，研究發現HCC 患者中較高的TMEM88 表達與更好的預后相關。經過Kaplan-Meier 繪圖儀數據分析發現，高TMEM88 表達與HCC 患者更好的OS、PFS 和RFS 相關。這些結果表示，TMEM88 在HCC 組織中具有保護的功能。使用UALCAN 工具分析結果發現，TMEM88在肝臟正常組織與肝臟腫瘤組織不同臨床病理因素中的磷酸化水平平均值和數值范圍均有明顯的差異。HCC 患者不同臨床病理分期因素結果顯示，正常肝臟組織與I 期肝癌組織、正常肝臟組織與II 期肝癌組織、正常肝臟組織與III 期肝癌組織、正常肝臟組織與IV 期肝癌組織和I 期肝癌組織與II 期肝癌組織的差異表達水平有意義?；颊卟煌朔N因素顯示，正常肝臟組織與白種人患者組織、正常肝臟組織與非裔美籍患者組織、正常肝臟組織與亞裔患者組織和白種人患者組織與亞裔患者組織的差異表達水平有意義。分析患者性別的因素，結果顯示，正常肝臟組織與男性患者組織和正常肝臟組織與女性患者組織的差異有意義。分析患者年齡因素，結果顯示，正常肝臟組織與21 歲至40 歲患者組織、正常肝臟組織與41 歲至60 歲患者組織和正常肝臟組織與61 歲至80 歲患者組織的數值差異均有統計學意義。分析患者體重因素，結果顯示，正常肝臟組織與正常體重患者組織、正常肝臟組織與超重患者組織、正常肝臟組織與肥胖患者組織和正常肝臟組織與極度肥胖患者組織的數值差異均有統計學意義。分析患者肝癌評級因素，結果顯示，正常肝臟組織與1 級患者組織、正常肝臟組織與2 級患者組織、正常肝臟組織與3 級患者組織、1 級患者組織與3 級患者組織、1 級患者組織與4 級患者組織和2 級患者組織與4 級患者組織的差異有意義。分析淋巴結轉移因素，結果顯示，正常肝臟組織與NO 患者組織的差異有意義。分析TP53 的突變狀態因素，結果顯示，正常肝臟組織與有TP53突變的組織、正常肝臟組織與沒有TP53 突變的組織和有TP53 突變與沒有TP53 突變組織的差異均有意義。分析肝癌亞型因素，結果顯示，正常肝臟組織與HCC 患者組織和HCC 患者組織與FL-HCC 患者組織的差異有意義。這些結果表示TMEM88 的表達水平在HCC 患者的所有臨床病理因素中均有影響且發揮作用。

低TMEM88 表達與男性、2 級患者、3 級患者、黃種人種和不酗酒的患者較差的OS 和較差的PFS 相關，與女性、2+3 期患者、3 期患者、3+4 期患者、AJCC_T 2 級患者、AJCC_T 3 級患者和有微血管侵犯患者較差的OS 相關，與 1 期患者、1+2 期患者、白人患者、酗酒的患者、肝炎病毒患者和無肝炎病毒患者的PFS 較差相關。然而，TMEM88 表達情況與2 期患者、1 級患者或AJCC_T 1 級患者的OS 或PFS 無任何相關性。

GEPIA 數據庫的基因表達分析顯示，低TMEM88 表達與HCC 較差的預后相關。此外，TMEM88 表達與特定免疫細胞標志物如單核細胞標志物（CD86 和CD11b）、中性粒細胞標志物（CCR7）、腫瘤相關巨噬細胞標志物（CD68）、T 輔助細胞1 標志物（IFN-γ，STAT1，T-bet 和TNF-α）、T 輔助細胞2 標志物（STAT6）、調節性T 細胞標志物（CCR8 和TGF-β）、耗竭性T細胞（CTLA4，PD-1 和TIM-3）有密切的相關性。調節性T 細胞標志物CCR8 只在HCC 組織中表達，并未在正常組織中被發現。

TMEM88 的腫瘤抑制作用在非小細胞肺癌中得到驗證[16]。由于其啟動子的高度甲基化，該疾病中出現低TMEM88 表達，而高TMEM88 甲基化預示著患者的總體存活率較短[16]。此外，通過去甲基化處理，TMEM88 在非小細胞肺癌細胞中的上調顯著降低了細胞增殖和侵襲[16]。在從不吸煙的患者肺腺癌細胞中也發現了低TMEM88 表達，并且TMEM88 有助于肺腺癌細胞的抗腫瘤作用[28]。

另一方面，TMEM88 也具有致癌功能。在乳腺癌、結腸癌、胃癌和肝細胞HCC 患者的腫瘤組織中檢測到高TMEM88 表達[14]。TMEM88 通過促進 Snail 轉錄因子的表達水平加速三陰性乳腺癌的侵襲和轉移[15]。TMEM88 的高表達也通過抑制緊密連接相關蛋白的表達來促進非小細胞肺癌的增殖和轉移[14]。這些發現表明，TMEM88 具有加速腫瘤發展的作用。TMEM88 在腫瘤發生中的這些相反作用表明，這種蛋白質的確切功能可能是視情況而立的。因此，TMEM88 在腫瘤進展中的表達和確切作用需使用不同的腫瘤類型進一步研究。

Geng 等人的研究首次揭示了TMEM88 在甲狀腺癌中的關鍵作用[29]。其數據表明TMEM88 在甲狀腺癌中的表達較低，而TMEM88 的高表達在甲狀腺癌細胞中發揮了相當大的抗腫瘤作用[29]。TMEM88 介導的抗腫瘤作用的潛在分子機制與其對甲狀腺癌細胞中Wnt/β-catenin 信號傳導的負調控有關[29]。其研究也證實了TMEM88 是調節Wnt/β-catenin 信號傳導的關鍵成分，在甲狀腺癌的進展中發揮重要作用[29]。TMEM88 是Wnt/β-catenin 信號傳導的關鍵調節因子。

在肝臟組織中，有研究發現TMEM88 可以通過阻斷Wnt/β-catenin 信號通路中肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的增殖和炎癥抑制肝纖維化的過程[11-12]。Manka 等人的研究發現也證實了細胞外基質過度積累會導致肝纖維化[30-32]，β-catenin 是一種關鍵的促纖維化因子，并且與多種組織纖維化的發病機制有關[33-34]。TMEM88 通過TGF-β1 刺激HSC LX-2 中的Wnt/β-catenin 信號通路來調節肝纖維化和HSC 的活躍程度[35]。不僅如此，TMEM88 通過在瘢痕組織形成過程中下調Wnt/β-catenin 信號傳導來抑制瘢痕組織成纖維細胞增殖和細胞外基質表達[10]。

相關研究闡明了TMEM88 在非酒精性脂肪肝中的調節作用及其內在機制。Zhou 等的研究發現，與正常組織相比，TMEM88 在脂肪肝組織中的表達明顯降低[36]。TMEM88 可能在游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）誘導的小鼠正常肝細胞（alpha mouse liver 12，AML-12）細胞中發揮不可或缺的作用[36]。在游離脂肪酸誘導的AML-12 細胞和蛋氨酸/膽堿缺乏飲食（methionine/choline deficient diet，MCD）喂養的小鼠中，非酒精性脂肪肝中固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）和脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）的表達水平較高，而?；o酶A 氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX-1）和過氧化物酶體增殖物活化受體-α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α）的表達水平較低[36]。體內脂質代謝細胞因子SREBP-1c、PPAR-α、脂肪酸合酶和ACOX-1 的分泌受TMEM88 的調節。此外，通過用pEGFP-C1-TMEM88 轉染游離脂肪酸誘導的AML-12 細胞，脂肪酸合酶和SREBP-1c 下調，而PPAR-α 和ACOX-1 上調[36]。游離脂肪酸誘導的TMEM88 siRNA 細胞內轉染可導致脂肪酸合酶和SREBP-1c 過表達，而PPAR-α 和ACOX-1 的表達降低[36]。因此，TMEM88 的基線水平細胞脂質代謝細胞因子基因的表達有相關性，它可以增加AML-12 細胞中脂質氧化細胞因子的水平，并負調節脂質合成[36]。在游離脂肪酸誘導的AML-12 細胞中，TMEM88 跨膜蛋白和Wnt/β-catenin信號通路可以相互調節細胞脂質代謝細胞因子的分泌[36]。

近年來，Gu 等人的研究發現，CC 趨化因子配體14（CCL14）基因表達水平與肝細胞癌不良預后相關[37]。CCL14 在肝癌組織中的表達水平比在正常肝組織中低，CCL14 高表達與患者較好的OS 和PFS 有關[37]。在男性、黃種人、酗酒者、無酗酒者和無肝炎病毒感染的患者中，CCL14 低表達與較差的OS 和PFS 相關[37]。在1+2 期或2級HCC 患者中，CCL14 的低表達與OS 和PFS 的惡化相關[37]。而在女性、1 級患者、血管侵犯患者和肝炎患者中，CCL14 的表達與OS 和PFS 無關[37]。此外，在觀察CCL14 表達水平與免疫細胞的關系中發現，其與B 細胞、CD4+和CD8+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的浸潤呈顯著負相關[37]。CCL14 的表達還與輔助性T 細胞不同亞群標志物的表達有關，包括Th1（T-bet、STAT-1、干擾素-γ 和腫瘤壞死因子-α）、Th2（STAT6）、Tfh（IL-21） 和Tregs（CCR8、STAT5B 和轉化生長因子-β）[37]。耗竭T 細胞標志物PD-1、CTLA-4 和TIM-3 表 達 與CCL14 的表達呈負相關[37]。

原發性和繼發性腫瘤部位的免疫反應取決于浸潤到腫瘤微環境中的不同類型的免疫細胞。不同類型免疫細胞的浸潤受到各種趨化因子的嚴格調控，這些趨化因子調節腫瘤免疫和腫瘤的生物學表型，也影響腫瘤進展、治療反應和預后[19-21]。

本研究結果受以下幾個因素影響：首先，本研究基于從已發表文章、公共數據存儲庫以及與研究作者的交流中檢索到的數據。因此，數據的質量會影響研究結果。其次，數據庫中的樣本數量不斷受到監督和擴展，這可能會影響本研究的結果。第三，用于評估的數據庫統計方法的準確性和選擇可能會影響研究結果的解釋說明。然而，本研究通過分析多個數據庫獲得了相似的結果，支持了本研究結論。

本研究也存在一定的局限性。首先，對TMEM88 在腫瘤中作用的研究基于Kaplan-Meier繪圖儀、GEPIA 和TIMER 數據庫中收錄的數據。然而，本研究沒有通過測試臨床樣本來驗證這些結果。其次，數據庫中一些個體腫瘤的樣本量很小。第三，沒有進行動物實驗來證實TMEM88 在HCC 生長和進展中的作用，以及它與免疫細胞浸潤到腫瘤微環境中的關系。因此，需要進一步研究驗證TMEM88 在HCC 中的作用。

本研究表明TMEM88 mRNA 水平與HCC 患者的預后相關。即使肝癌細胞中的TMEM88 表達高于正常肝細胞，高TMEM88 mRNA 水平與HCC患者更好的OS、PFS 和RFS 相關。TMEM88 的表達水平，在HCC 患者的臨床分期、人種、性別、年齡、體重、肝癌評級、是否有淋巴結轉移、是否有TP53 突變或肝癌亞型等因素中均高于其在肝臟正常組織的表達水平。TMEM88 的下調與臨床特征相關的患者預后較差有關，例如男性、黃種人、不酗酒的患者、肝癌評級2 級和3 級患者。TMEM88 是一種有潛力的獨立預后生物標志物，可用于評估腫瘤組織中免疫細胞浸潤的水平。HCC 中相對高水平的TMEM88 可能表明治療后腫瘤復發的風險更大，此類患者需進行密切的醫療監督。

TMEM88 的表達貫穿所有HCC 病理分期，且在腫瘤組織跟正常肝臟組織的表達水平差異明顯。此外，TMEM88 深度缺失影響肝臟組織的正常遺傳功能， 沒有任何異變或擴增的遺傳變異情況。再者，TMEM88 在肝臟腫瘤細胞中的MCPCOUNTER 浸潤情況、XCELL 浸潤情況及TIDE 浸潤情況均呈正相關。研究表明TMEM88在HCC 里是一種起保護作用的基因，具有能促進免疫逃逸的功能。