亞低溫治療對心肺復蘇后大鼠膈肌功能的影響

嚴 宇，周賢龍，鄒星南，盧梓俊，趙 剡

武漢大學中南醫院急救中心（武漢 430071）

心搏驟停仍是引起臨床突發性死亡的首要原因。心肺復蘇是公認的搶救心搏驟停病人最有效的方式，但復蘇后的缺血再灌注性損傷繼發多器官功能障礙，仍是導致病人死亡的首要因素[1]。膈肌是人體最主要的呼吸肌，缺血再灌注性損傷同樣會影響膈肌的功能[2]。通常心肺復蘇成功的病人往往需要以機械通氣為基礎的高級生命支持，但長時間的機械通氣較容易導致膈肌發生功能障礙[3]。臨床上發生功能障礙的膈肌表現為收縮力的下降和膈肌纖維的萎縮，從而引起呼吸機撤機困難，增加病人的死亡風險[4]。

目前認為，過度的氧化應激和炎癥反應是危重病人膈肌功能障礙的主要發生機制，減輕氧化應激和炎癥刺激是改善膈肌功能障礙的主要手段[5]。亞低溫治療是減輕復蘇后機體氧化應激損傷和炎癥反應的重要手段之一[6]，通過將全身或局部體溫控制在30～35℃，可以顯著改善心、腦、肝等重要臟器的缺血再灌注性損傷[7]，但其對心肺復蘇后膈肌功能的影響仍不明確。本研究旨在探討亞低溫治療對心肺復蘇后膈肌收縮力、纖維橫截面積（cross-sectional area，CSA），以及炎癥反應和氧化應激指標的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

8 周齡SPF 級雄性Wistar 大鼠由武漢萬千佳興實驗動物公司提供。動物飼養于武漢大學動物實驗中心，維持溫度在25℃、濕度約50%，并保持12 小時晝夜交替和自由進食水。TNF-α（ab236712）、IL-6（ab234570）和MDA（ab118970）檢測試劑盒和一抗（MY-32，ab51263；NQD7.5.4D，ab11083；laminin，ab11575）均購自Abcam（上海）公司，二抗（Alexa Fluor 546 標記的驢抗小鼠，A10036；Alexa Fluor 488 標記的驢抗兔，A-21206）購自賽默飛（上海）公司，臺氏液購自武漢普諾賽公司。體外肌肉收縮力檢測系統購自奧爾科特（上海）公司，小動物呼吸機購自Harvard（美國）公司，體溫維持儀購自軟?。ū本┕?，生命體征監測儀器購自泰盟（成都）公司，熒光顯微鏡（Olympus，日本）由武漢大學中南醫院科研中心提供。

1.2 實驗動物與分組

將46 只雄性Wistar 大鼠隨機分為對照組（Sham）、正常體溫組（NT 組）、正常體溫復蘇組（NTR 組）、亞低溫組（MT 組）、亞低溫復蘇組（MTR 組），其中Sham 組6 只、其余實驗組每組各10 只。Sham 組：大鼠行假手術后體溫維持在正常水平（37±0.5℃）并自主呼吸12 小時；NT 組：大鼠行假手術后體溫維持在正常水平（37±0.5℃）并持續機械通氣12 小時。NTR 組：大鼠心肺復蘇后體溫分別維持在正常水平（37±0.5℃）并持續機械通氣12 小時。MT 組：大鼠行假手術后體溫維持在亞低溫水平（33±0.5 ℃）并持續機械通氣12 小時；MTR 組：大鼠心肺復蘇后體溫維持在亞低溫水平（33±0.5℃）并持續機械通氣12 小時。該實驗經武漢大學動物實驗中心實驗動物管理與使用委員會批準（2021034）。

1.2 心肺復蘇模型構建

大鼠心肺復蘇模型構建方法參照文獻[8]。戊巴比妥鈉（60 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，將大鼠置于保溫毯上。體溫監測探頭通過肛門進入體內約4 cm 深度用于監測體溫。經頸氣管切開后置入14F 氣管導管，使大鼠保持自由呼吸，并經右側頸外靜脈和左側頸動脈分別置入24F 和22F 導管。將葡萄糖生理鹽水（1 mL·kg-1·h-1）和戊巴比妥鈉（10 mL·kg-1·h-1）通過右側頸外靜脈導管持續泵入。左側頸動脈導管連接生命體征監測儀，動態監測大鼠動脈血壓和血氣。氣管導管連接小動物呼吸機，夾閉窒息法構建心搏驟停，以平均動脈壓小于20 mmHg 且無動脈波形判定為心跳停止。心跳停止后立即開始胸前按壓和機械通氣，胸前按壓頻率為200 次/分，按壓呼吸比為2 ∶ 1。每30 秒為一次心肺復蘇組，并持續直至恢復自主循環。3 個心肺復蘇循環后，仍未恢復自主循環判定為心肺復蘇失敗?；謴妥灾餮h定義為：平均動脈壓在60 mmHg 以上并維持至少5 分鐘。在恢復自主循環后的1 小時和2 小時分別吸入純氧和50%氧濃度的空氣混合氣體，之后吸入空氣。機械通氣參數設置為頻率60～70 次/分，潮氣量6 mL·kg-1，吸呼比1 ∶ 1，呼氣末正壓2 cmH2O。整個過程中不使用血管活性藥物。心肺復蘇成功后將大鼠置于冰袋上進行降溫，MT 組和MTR 組大鼠體溫維持在（33 ℃±1 ℃）。NT、NTR 和Sham 組大鼠在整個實驗過程中體溫均維持在正常水平（37℃）。按照各組設計進行12 小時的機械通氣或自主呼吸。每4 小時監測一次動脈血氣，根據血氣結果調整呼吸機通氣參數，維持機械通氣大鼠動脈血氧分壓在80～100 mmHg，二氧化碳分壓小于50 mmHg。實驗結束后，采用過量戊巴比妥鈉（150 mg·kg-1）注射的方法處死大鼠，采集相關組織標本進行檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1 基礎生命體征

包括大鼠的體溫、心率、平均動脈壓（MAP），動脈血氣指標包括pH、氧分壓PaO2、二氧化碳分壓PaCO2、碳酸氫根HCO3-、血乳酸水平，以及血常規指標（淋巴細胞比例和中性粒細胞比例）。

1.3.2 大鼠膈肌收縮力

參照既往研究的方法[9]，在體外進行膈肌收縮力測量。處死大鼠后，迅速剪取左側肋弓下膈肌組織，修剪成約5 mm × 3 mm 的肌條。金屬固定夾固定肌條上下兩端，垂直放于27℃，95% O2和5% CO2的混合氣體持續氧合的臺氏液中20 分鐘。之后在刺激電壓10 V、波長2 ms、刺激間隔2 分鐘的條件下開始獲取膈肌的最佳初長度，并在最佳初長度下獲取最大強直收縮力、頻率－收縮力曲線和疲勞指數。測量結束后，游標卡尺測量肌條在最佳初長度下的物理長度（cm）和濕重。按照肌肉的密度，分析每個肌條在最佳初長度下的橫截面積（橫截面積=濕重/密度/肌條長度）。

1.3.3 大鼠膈肌纖維橫截面積與形態

新鮮的膈肌組織OCT 包埋后液氮速凍，用冰凍切片機制備厚度約7 μm 的薄片。切片經甲醇固定30 秒后，PBS 洗滌三次，每次1 分鐘。5%BSA室溫下封閉30 分鐘，PBS 沖洗掉多余的BSA，添加一抗（NQD7.5.4D），按1∶300 比例覆蓋組織，4℃孵育過夜。PBS 洗滌三次，每次5 分鐘，添加二抗（Alexa Fluor 546），室溫下孵育1 小時。PBS 洗滌三次，每次5 分鐘?？篃晒獯銣鐒┓馄?，熒光顯微鏡下觀察、拍照。參照既往研究方法[9]，ImageJ 軟件計算分析每個纖維的橫截面積，每片膈肌組織至少分析200 條不同的肌纖維。4%多聚甲醛固定的膈肌標本，采用常規石蠟切片行HE 染色，并在顯微鏡下觀察拍照大鼠膈肌纖維形態。

1.3.4 大鼠膈肌氧化應激和炎癥指標

新鮮的膈肌組織約30 mg，加入500 μL 的RIPA 裂解液冰上勻漿，4℃離心后獲取上清液，根據MDA、TNF-α 和IL-6 相關檢測試劑盒的使用說明書進行指標的定量分析。

1.4 統計分析

數據經Excel 導入Prism 軟件中進行分析。采用Shapiro-Wilk 方法檢驗數據的正態分布情況，正態分布數據以均數和標準差（±s）描述，多組間樣本均數的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基礎生命體征

實驗結束時，MTR 組和MT 組大鼠的體溫、心率和血乳酸水平顯著低于NT 組和NTR 組（P＜0.05），但四組大鼠之間的平均動脈壓（MAP）、動脈血氣指標（pH、PaO2、PaCO2、HCO3-）、血常規指標（中性粒細胞比例和淋巴細胞比例）均無顯著差異。Sham 組與NT 組大鼠之間在上述指標方面的差異均無統計學意義（表1）。

表1 各組大鼠在實驗結束時的生命體征、動脈血氣和血常規指標Table 1. Characteristics of vital signs, arterial blood gas and blood routine of rats in each group at the end of the experiment

2.2 大鼠膈肌收縮力

與Sham 組相比，各實驗組大鼠的膈肌收縮力指標均明顯下降（P＜0.05）。其中，NT、MTR 和NTR 組大鼠膈肌最大緊張收縮力、最大強直收縮力、40Hz 至120Hz 刺激頻率下的收縮力和疲勞指數均顯著小于MT 組（P＜0.05）。NTR 組的上述指標顯著小于MTR 組，且均小于NT 組（圖1）。

圖1 各組大鼠膈肌收縮功能參數Figure 1. Diaphragmatic contractile function parameters in each group of rats

2.3 大鼠膈肌纖維橫截面積與形態

與Sham 組相比，各實驗組大鼠的Ⅰ型和Ⅱ型膈肌橫截面積均顯著減?。≒＜0.05）。其中，NT、MTR 和NTR 組大鼠的Ⅰ型和Ⅱ型膈肌CSA 均顯著小于MT 組（P＜0.05）。NTR 組大鼠的I 型和Ⅱ型膈肌CSA 顯著小于MTR 組，且均小于NT組（圖2）。HE 染色觀察下，五組大鼠膈肌纖維均輪廓完整，排列規則，間質未見水腫、出血和明顯炎癥細胞浸潤現象。

圖2 各組大鼠膈肌纖維橫截面積、免疫熒光及HE染色形態學觀察Figure 2. The cross-sectional area, immunofluorescence and HE staining morphology of diaphragm fibers in each group of rats

2.4 大鼠膈肌氧化應激和炎癥指標

NT、MTR 和NTR組大鼠膈肌的MDA、TNF-α和IL-6水平均顯著高于MT組（P＜0.05）。NTR 組大鼠的MDA、IL-6 和TNF-α 水平顯著高于MTR 組，且都顯著高于MT 組。各實驗組的上述指標均顯著高于Sham 組（圖3）。

圖3 各組大鼠的膈肌MDA、TNF-α和IL-6水平Figure3. The levels of MDA、TNF-α and IL-6 in diaphragm in each group of rats

3 討論

本研究發現，心肺復蘇引起的缺血再灌注會顯著降低膈肌的收縮力，減少膈肌纖維橫截面積，引起顯著的膈肌功能障礙。采用亞低溫治療可有效改善心肺復蘇后的膈肌功能障礙，這可能與其降低氧化應激水平、抑制炎癥反應損傷有關。

心肺復蘇后的缺血再灌注損傷一直是臨床上面臨的巨大挑戰。心搏驟停后，機體各器官的血供大幅減少，組織處于缺氧狀態。當缺血細胞再灌注重新獲得氧供的短時間內，中性粒細胞大量激活，耗氧量顯著增加[10]，產生的活性氧和活性氮類物質增多，超過機體對其清除能力，則引起氧化應激[11-12]。臨床上危重病人常伴有不同程度的膈肌功能障礙[13]，過度的氧化應激和炎癥反應是引起膈肌功能障礙的主要機制[14]。多項動物研究指出，使用氧自由基清除劑能夠有效減輕膈肌功能障礙的程度[15-17]。而亞低溫是臨床上行之有效的降低心肺復蘇后氧化應激損傷的方法之一[18]，但目前亞低溫對膈肌本身功能的影響仍未明確。國外有研究指出，31℃時可以保護人體膈肌的收縮功能[19]，但動物實驗顯示更進一步的低溫（15℃）會導致膈肌收縮力下降[20]。本實驗結果表明，亞低溫（33±0.5℃）并不會影響膈肌本身的功能，還能夠有效改善因機械通氣引起的膈肌功能障礙。機械通氣引起膈肌功能障礙的機制主要是線粒體功能障礙，活性氧或活性氮類物質生成增多，進而激活一系列蛋白降解通路，并抑制蛋白合成通路，從而導致膈肌發生萎縮、收縮力下降[21]。此外，氧自由基還可以通過損傷肌球蛋白直接引起收縮力下降。心肺復蘇后往往需要以機械通氣為基礎的高級生命支持治療，而長時間的機械通氣易導致膈肌發生失用性萎縮。在心肺復蘇后，膈肌面臨著缺血再灌注和失用性萎縮兩大危險因素，缺血再灌注后短時間內形成的氧化應激風暴可能加重膈肌功能障礙的程度，或加速其出現的時間。本研究結果顯示MTR 組的膈肌收縮力和纖維橫截面積顯著小于NT 組，進一步說明了缺血再灌注對膈肌功能的負面影響。

此外，本研究還發現亞低溫能夠減輕心肺復蘇后大鼠膈肌TNF-α 和IL-6 升高的幅度，說明亞低溫對減輕炎癥反應具有一定作用。全身炎癥反應綜合征是心肺復蘇后機體出現的重要體征之一，且有研究指出全身的炎癥反應與心搏驟停的時間有關[22]。在本實驗中，大鼠心搏驟停后立刻開始心肺復蘇，但這并不能夠抑制膈肌炎癥反應的出現。一些炎癥因子，如IL-6 的上調表達可通過STAT3/JAK 通路引起下肢骨骼肌的萎縮[23]。亞低溫可能是直接通過抑制炎癥因子釋放的方式來保護缺血再灌注后的膈肌功能。此外，炎癥反應和氧化應激之間相互促進和相互制約的關系會影響膈肌功能。例如，IL-6 可以通過刺激血管緊張素Ⅱ1 型受體的方式誘導內皮細胞的氧化應激損傷[24]，但IL-6 也可通過增強抗氧化和自噬的途徑減輕胰腺β 細胞的氧化應激[25]。目前，在膈肌功能障礙的發生機制中，炎癥反應和氧化應激之間的相互關系仍沒有完全闡釋清楚。對于心肺復蘇后的膈肌，氧化應激和炎癥反往往同時存在，而亞低溫能夠有效減輕心肺復蘇后膈肌的氧化應激和炎癥反應損傷。

本研究仍存在以下局限。第一，膈肌收縮力體外檢測時的溫度（27℃）低于動物實際體溫（33±0.5℃或37±0.5℃）。國內外研究一致認為，體外肌肉收縮力檢測時，27℃能獲得肌肉的最大收縮力。雖然肌條在臺式液中平衡20 min，但溫度短時間內的改變對肌肉真實收縮力的影響無法完全避免。第二，胸外按壓時對膈肌可能造成的損傷不能確定。按壓過程中可能存在按壓幅度過深的情況，這種情況下，胸廓的回彈（尤其是末端肋骨）可能對膈肌造成牽拉性損傷。第三，建立的心肺復蘇模型不能完全模擬臨床。為避免血管活性藥物對膈肌的影響，在大鼠心肺復蘇過程中未使用此類藥物，而在臨床上，常常使用血管活性藥物來增加心肺復蘇的成功率。

基于本實驗結果，將來在臨床上可以通過超聲或跨膈壓力檢測的方法，明確亞低溫對心肺復蘇后患者膈肌功能的影響，以期能夠為臨床有效預防膈肌功能障礙提供參考。