Notch信號通路調控T細胞免疫在氣道炎癥性疾病中的作用

趙競一，王俊閣

作者單位：100010 北京，首都醫科大學附屬北京中醫醫院耳鼻咽喉科

氣道炎癥性疾病是以氣道炎癥、氣道阻塞和組織重塑為特征的感染性或變態反應性疾病，包括變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)、慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)、支氣管哮喘(bronchial asthma，BA)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等。氣道炎癥的發生機制較為復雜，迄今尚未完全闡明，已知多種炎癥細胞、細胞因子以及信號轉導途徑共同參與其中。在氣道炎癥中有一系列的信號通路激活，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、核因子激活的B細胞κ-輕鏈(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信號通路、Janus激酶/轉錄激活因子(Janus tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路及Notch信號通路等，各自發揮多種分子生物學功能。其中Notch信號通路是一個高度保守的信號系統，能夠調節細胞分化、運動和干細胞增殖等，決定細胞命運和組織形態，對臟器的形態和功能產生影響。T淋巴細胞作為氣道炎癥中機體免疫應答的重要組成部分，在對抗各種病原體中發揮重要的免疫作用，近年來關于Notch信號通路與T細胞之間相互作用的研究也逐漸深入，Notch信號在氣道炎性疾病中的作用機制研究及靶向藥物治療成為一大熱點。本文就Notch信號通路調控T細胞免疫在氣道炎癥性疾病中的研究進展進行綜述。

1 Notch信號通路的組成與激活

1917年，由“遺傳學之父”Thomas Hunt Morgan首先描述，突變體果蠅存在一種基因，其功能缺失會導致果蠅翅膀邊緣出現缺刻(notch)，故而得名Notch基因。Notch基因編碼一系列跨膜受體蛋白，后者構建包括Notch受體、Notch配體、CSL-DNA結合蛋白以及下游靶基因在內的信號傳導通路，參與細胞生長、分化、凋亡甚至突變等重要環節，是決定細胞命運的重要基因[1]。

Notch受體為Ⅰ型跨膜蛋白，分為胞外域、跨膜蛋白和胞內域三部分，在哺乳動物中有4種類型(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)。胞外域為異二聚體蛋白，包含29～36個用于結合Notch配體的表皮生長因子樣重復序列，以及3個富含半胱氨酸的重復序列和1個異二聚化結構域，用于阻止配體無關的信號傳導?？缒さ鞍缀幸粋€S3裂解位點。胞內域由隨機結構域、錨蛋白重復序列、核定位信號、反式激活結構域及P序列組合而成[2]。Notch配體同樣為Ⅰ型跨膜蛋白，分為Delta like(DLL1、DLL3、DLL4)和Jagged(JAG1、JAG2)兩類，其N端為Notch受體結合和活化所必須的DSL(Delta/Serrate/Lag-2)基序，隨后根據配體的種類具有不同數量的表皮生長因子樣重復序列[3]。

Notch信號的激活和傳導是一種即時通訊，通過配體-受體交互作用發揮功能。典型的傳遞途徑是，Notch配體蛋白與受體胞外域結合后，經過弗林(furin)蛋白酶、金屬蛋白酶及γ-分泌酶于S1～S3酶切位點的三步酶切過程，配體蛋白被切斷并釋放具有轉錄調節活性的胞內域，后者與重組結合蛋白Jκ(recombination signal sequence-binding protein Jκ，RBP-Jκ)結合，調控下游基因表達[4-5]。另外，Notch信號傳導也可以通過非RBP-Jκ途徑調節相關基因的表達。這兩種從細胞表面受體到細胞核基因組的信號傳遞是直接的、線性的，沒有信號級聯放大的過程[6]。

2 Notch信號通路對T細胞的調控作用

Notch信號參與T細胞多階段的發育和分化過程，調節細胞活化及免疫活動，對其發育和功能具有顯著影響。

2.1 Notch信號調節T細胞分化

T細胞分化依賴Notch信號途徑。在胸腺表達的Notch蛋白作用下初始T細胞發育為雙陰性1細胞(double negative 1，DN1，CD44+CD25-CD4-CD8-)，繼而增殖分化為雙陰性2細胞(double negative 2，DN2，CD44+CD25+CD4-CD8-)并表達高水平CD25[7]。隨著Notch信號的目的基因Hes1(hairy and enhancer of split 1)表達增加，DN2細胞的增殖逐漸減少并轉化為DN3細胞(double negative 3，CD44-CD25+CD4-CD8-)，同時Gata3(GATA-binding protein 3)、Tcf7(transcription factor 7)、Runx1(RUNX family transcription factor 1)等重要T細胞基因在此階段達到表達峰值。DN3細胞依據CD27表達量的高低，可分為DN3a和DN3b兩種亞型(后者高表達CD27)，其DNA位點β、γ及δ重排后生成多種T細胞受體鏈(T cell receptor，TCR)，在Notch信號的參與下，通過β-選擇及γδ -選擇過程分化為對應的αβT細胞或γδT細胞[8]；同時DN3細胞向DN4細胞(double negative 4，CD44-CD25-CD4-CD8-)轉化，隨后在Notch信號誘導下DN4細胞向CD4+CD8+雙陽性αβT細胞(double positive，DP)分化。其中CD4受體與MHC(major histocompatibility complex)Ⅱ型配體結合，促使DP向CD4+T細胞轉化；CD8受體與MHC Ⅰ型配體結合，促使DP向CD8+T細胞轉化，該步驟同樣由Notch信號介導[9]。Notch分子在CD4+T細胞表面廣泛分布，通過誘導Tbx2(T-box transcription factor 2)、Gata3、FOXP3(forkhead box protein P3)、ROR-γt(etinoic acid receptor-related orphan receptor γt)表達，使初始CD4+T細胞在外周接受抗原刺激后分化為T輔助細胞(Th)，包括Th1、Th2、Th17及T調節細胞(Treg)[10-12]，執行不同的防御功能以滿足機體免疫反應的需要。值得注意的是，Notch信號在人類和小鼠中的作用并非完全一致，人類Notch信號可有效促進γδT細胞分化，而小鼠只有DN2細胞向γδT17細胞分化時由Notch-Hes1通路介導，其余亞型γδT細胞的分化不需要Notch信號參與[13]，這種現象可能與人類和小鼠胸腺中Notch配體的表達種類不同有關：小鼠胸腺表達Dll4，而人類胸腺內表達的是JAG2[14]。因此，基于小鼠模型的Notch信號研究成果向人類治療途徑轉化時應注意兩者之間的差異性。

2.2 Notch信號調節T細胞活化

Notch信號通路參與調節多種T細胞的活化。TCR被MHC復合體激活后，引起Notch受體釋放胞內域[15]并進行細胞內信號傳導，從而維持T細胞激活狀態。例如，Notch1-RBP-Jκ-IL-7Rα通路可使小鼠γδT17細胞維持激活狀態，持續造成組織損傷[16]。又如，Notch信號非經典途徑可與雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)共同作用，激活PKB信號并保護線粒體功能，減輕細胞核損傷，從而維持T細胞的生存狀態[17]。Vγ9Vδ2T細胞是人體外周血循環中主要的γδT細胞亞群，在抗炎、抗腫瘤活動中發揮重要作用，研究通過高通量轉錄組學發現，阻滯Notch信號可顯著抑制Vγ9Vδ2T細胞激活，并下調與其殺傷功能相關的基因表達[18]。此外，樹突狀細胞通過Notch信號上調醛脫氫酶1家族成員A2(aldehyde dehydrogenase 1 family member a2，Aldh1a2)轉錄，增加維甲酸的合成，促進Th17細胞活化并調節Th17/Treg細胞數量平衡[19]。

2.3 Notch信號調節T細胞免疫功能

Notch信號對T細胞的功能發揮有重要的調節作用。TCR信號可激活Notch-RBP-Jκ經典信號通路，后者可通過NF-κB通路反饋調節T細胞的增殖并增加干擾素γ(interferon-gamma，IFN-γ)的釋放，繼而增強T細胞免疫活性[20]。另外，Notch信號可通過增強T細胞表面白細胞介素(interleukin，IL)-2受體CD25的表達，使T細胞結合更多的抗原并降低T細胞的反應閾值[21]。Notch信號可通過上調穿孔素和顆粒酶B的表達，增強CD8+T細胞的殺傷力[22]；研究發現在甲型H1N1流感患者中，Notch受體和配體的表達明顯升高，信號通路的激活可增強病毒特異性CD8+T細胞的殺傷功能[23]。若抑制正常人外周血CD8+T細胞的Notch1信號通路，其IFN-γ、IL-2及顆粒酶B的釋放將受到明顯抑制[24]。若使用γ分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor，GSI)抑制γδT細胞Notch信號通路，或敲除其Notch基因，則γδT細胞釋放IFN-γ明顯減少，且對于磷酸抗原和抗CD3抗體刺激的細胞反應性降低，細胞殺傷力減弱[15]。

3 氣道炎癥性疾病中以Notch信號調控T細胞為靶點的相關研究

3.1 變應性鼻炎

Notch信號在AR患者中高表達，其通路激活程度與特異性免疫球蛋白E(specific immunoglobulin E，sIgE)的水平呈正相關[25]。Notch1信號可下調轉錄因子FOXP3表達，從而抑制Treg細胞分化，并上調IL-6、IL-10的表達，最終促進變應性鼻炎發展，因此阻斷Notch1信號通路是治療AR的潛在途徑[25-26]。研究發現采用卵清蛋白致敏小鼠后，通過GSI阻滯小鼠Notch信號，小鼠過敏樣癥狀可明顯緩解，外周血Th2細胞因子IL-4、IL-5及特異性IgE抗體水平下降，鼻黏膜嗜酸性粒細胞浸潤及杯狀細胞化生明顯減輕，說明干預Notch信號對于AR的治療具有重要價值[27-28]。AR中不同亞型Notch受體在存在功能差異，如致敏小鼠模型外周血單個核細胞中Notch1、Notch3、Notch4的蛋白表達明顯高于正常對照組，而Notch2的表達較低[29]；有研究發現Notch2信號通路通過上調FOXP3表達，可促進Treg細胞的分化，顯著抑制AR炎癥反應[5]。中藥治療方面，研究表明單味中藥及復方制劑均可影響Notch信號通路功能，明顯抑制AR炎性因子水平，恢復T淋巴細胞亞群平衡[30-31]。

3.2 支氣管哮喘

研究發現，BA模型小鼠Notch配體Jagged1、Dll4呈現過表達，后者使小鼠外周血Th17/Treg細胞比例升高，阻斷Notch-Dll4信號通路對BA模型小鼠Th17細胞分化起到抑制作用[32]。小鼠中Notch1和Notch2可能是促進BA發病的主要信號通路，通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)分別阻斷小鼠Notch1～Notch4信號，其中Notch1和Notch2被阻斷后出現肺組織T細胞IL-4、IL-5表達降低，IFN-γ表達升高[33]。另外，BA模型小鼠Notch配體JAG1、JAG2的表達增加可能與氣道炎癥反應及黏膜重塑有關[34]，通過Notch1-Hes1信號通路可促進氣道平滑肌細胞的增殖，從而加重氣道的上皮下纖維化。Pyrin重組蛋白可通過下調Notch1-JAG1信號通路，減輕BA模型小鼠氣道炎癥及氣道重塑[35]。因此，對于以氣道重塑為核心的難治性哮喘，選擇Notch信號通路抑制劑可能是一種新的治療策略[36]。另外，Notch蛋白表達量與哮喘患者糖皮質激素治療效果呈負相關，聯合監測Notch1、Notch3表達水平有助于指導糖皮質激素藥物的應用[37]。

3.3 慢性阻塞性肺病

COPD模型小鼠存在T細胞亞群失衡，以Th1、Th17等促炎細胞增多為主；同時Notch1蛋白及其下游Hes1 mRNA水平升高，且與T細胞亞群失衡相關[38]，表明Notch1信號通路與COPD關系密切。GSI部分阻斷Notch1-Hes1通路可抑制Th1、Th17細胞分化，從而調節Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡[39]。2型固有淋巴細胞可通過Notch-Gata3信號通路促進Th2細胞分化，這可能是COPD急性加重的機制之一[40]。鼻病毒通過Notch3引起COPD小鼠持續性氣道杯狀細胞增生，阻斷Notch3可下調黏蛋白基因表達，減輕鼻病毒引起的杯狀細胞增生和分泌[41]。治療方面，研究表明補肺益腎方通過上調微小RNA34a表達、下調Notch3及Hes1蛋白表達，可抑制COPD大鼠氣道黏液分泌，改善COPD大鼠炎癥反應及免疫功能失衡[42-43]。和厚樸酚通過抑制COPD小鼠脾T細胞Notch信號通路的激活，糾正了COPD小鼠Th1/Th2和Th17/Treg細胞的失衡，從而使肺功能得以改善[44]。

3.4 其他氣道炎癥性疾病

Notch信號通路在伴有息肉的慢性鼻竇炎、毛細支氣管炎、支原體肺炎、病毒性肺炎、放射性肺炎及肺纖維化等疾病中均發揮重要作用。慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻黏膜上皮中Notch1/JAG1蛋白、IL-33表達增加，Notch1/JAG1通路激活可能抑制嗜酸性慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者Treg細胞功能，導致Th2型炎性反應和嗜酸性粒細胞浸潤加重[45-46]。通過毛細支氣管炎模型大鼠研究發現，靜脈注射GSI能夠阻斷Notch信號通路，并抑制其氣道炎癥反應[47]；臨床研究表明GSI可降低呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎患兒外周血單個核細胞Gata3水平[48]；黃芩苷可能通過Notch通路糾正Th17/Treg失衡來發揮對細支氣管炎的治療作用[49]，說明阻斷Notch信號通路可能對毛細支氣管炎有潛在的治療價值。支原體肺炎患兒Th17/Treg細胞比例失衡，肺功能下降，Notch信號通路表達增高，而后者可能干預Th17/Treg細胞分化，使Th17細胞因子IL-17等水平升高，參與支原體肺炎發生和進展[50]。中藥清肺透邪方可以減輕肺炎支原體肺炎模型小鼠肺組織炎癥，其機制可能與抑制肺組織Notch通路中Notch受體的表達有關[51]。姜黃素能夠減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠的炎性反應，其機制可能與Notch2/Hes-1通路相關[42]。呼吸道合胞病毒感染人肺上皮細胞后，通過Notch1/Hes1信號通路促進IL-25的釋放，并上調黏蛋白MUC5AC(mucin 5AC)表達，導致氣道黏液高分泌，而姜黃素衍生物對此具有抑制效應[53]。養陰清肺方可顯著下調放射性肺炎大鼠Notch1及JAG1蛋白表達，可能是其防治放射性肺炎發生發展的機制之一[54]。吳茱萸次堿可能通過抑制Notch1/eIF3a(eukaryotic translation initiation factor 3a)信號通路，減緩肺泡上皮細胞向間質細胞轉化的進程，從而緩解博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化[55]。

4 總結與展望

Notch信號通路是T細胞重要的信號傳導途徑，廣泛參與調控T細胞的分化、活化及免疫功能。Notch信號通過糾正Th1/Th2/Th17/Treg細胞失衡、上調細胞炎癥因子和黏蛋白表達、促進氣道組織重塑等方式，影響變應性鼻炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病等多種氣道炎癥性疾病的發生和發展，阻斷Notch信號或下調Notch蛋白表達可改善氣道炎癥狀態和免疫功能紊亂。未來應進一步研究Notch信號通路作用于T細胞的途徑和靶點，探究Notch信號通路對氣道炎癥的調節機制，制定氣道炎癥性疾病治療和預防的新策略。