猴痘病毒的感染與猴痘的動物模型

包 容

(武漢大學動物實驗中心/ABSL-3 實驗室, 武漢 430071)

猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)屬正痘病毒(Orthopoxvirus,OPXV)科成員。 在該病毒家族中,有十多個成員,但只有天花病毒、牛痘病毒、猴痘病毒等四種可感染人類。 在天花消滅之后,一種類似天花的疾病繼續在剛果(金)農村流行[1]。 1970 年當地兒童出現天花樣癥狀,猴痘病毒隨即從人痘疹標本中分離,該病毒對人致病的事實也得到確認[1]。 現在這種病毒正逐漸擴散到非洲以外的大洲,被感染的人群正逐漸擴大。 非人靈長類(nonhuman primates,NHPs)被認為是偶然的宿主;嚙齒類的非洲松鼠、非洲睡鼠是更可能的宿主,但并未完全確定。 以前的感染一般由密切接觸染病的野生動物或者寵物而引發;最近的猴痘病毒的傳播與感染對象呈現新的特點,同性戀和雙性戀成了猴痘病毒感染的主要群體,其致病性也正發生變化。MPXV 的感染因為動物種類、感染途徑、感染劑量、毒株等多種因素不同而有較大差異。 我國面臨境外猴痘病毒傳入的風險,因此有必要全面了解猴痘病毒的感染特點,并建立相應的動物模型。 本文論述了猴痘病毒的發現經過、流行與感染類型和多種動物的感染模型,并總結了多種嚙齒類、非人靈長類的感染以及多種類型的感染,如自然感染、隱性感染、顯性感染、共感染等;還介紹了各種實驗性感染與動物模型特點,包括動物對病毒的敏感性、病毒的組織嗜性,不同途徑的感染、不同毒株的感染等;希望對構建猴痘動物模型提供更多的認識。

1 猴痘病毒發現的經過與早期疫情

1958 年,來自馬來(西)亞的食蟹猴運輸到丹麥哥本哈根國家血清研究所后暴發兩次疫情。 部分猴出現痘疹,疑在運輸途中被感染。 曾發現缺損病毒的干擾現象的Von Magnus 分離出病原體,并鑒定為猴痘病毒[2]。 1964 年12 月,荷蘭鹿特丹動物園23 只動物被感染,11 只動物死亡。 疫情引發外界關注,1967 年WHO 調查歐美26 個靈長類機構,發現9 個(分別來自丹麥、荷蘭和美國)都曾暴發過猴痘或類似病情,其中5 次被病毒分離證實。 次年巴黎也暴發猴痘疫情,2 只來自塞拉利昂的黑猩猩出現廣泛性皮疹[2]。 在這些疫情中,被感染的主要是東南亞的食蟹獼猴(食蟹猴)和亞洲的普通獼猴(恒河猴),但是這些猴的老家并未發生類似疫情。

這被后來的病毒基因測序與序列分析所證實,以往多個MPXV 流行株都是西非來源;包括1958年的丹麥哥本哈根株、1962 年的Walter-Reed 陸軍研究所株、1964 年的荷蘭鹿特丹株、1968 年巴黎株以及2003 年的美國株等[3]。 不確定疫情是否全部與動物有關,可以肯定的是歐美國家眾多動物園與實驗機構的黑猩猩、多種非洲猴、狒狒均來源于非洲國家。 這也說明,說明猴痘與天花曾經同時在非洲和歐洲流行;所謂的小天花、類天花也可能是猴痘。 另外,在MPXV 分離鑒定之前,野生猴群中也發生過類似天花的疫情[4]。

2 非人靈長類與嚙齒類動物的自然感染

2.1 非人靈長類的自然感染

在丹麥猴痘疫情之后,亞洲猴首先被懷疑是可能的天然宿主。 1969 ～1970 年,1200 份亞洲猴血清檢測發現抗痘病毒抗體均為陰性,隨后更多的來自非洲稀樹草原的猴血清標本也未檢測到陽性[5]。從1969 年開始,多種西非的赤猴、狒狒的血清標本抗牛痘血凝抑制試驗(HI)檢測到陽性[6],1973 ～1974 年,對206 只西非NHP 的血清調查發現8%的樣本HI 陽性,21%樣本中和抗體陽性,包括以前被歸為長尾猴屬的非洲綠猴(C.aethiops)、西非紅疣猴和多種長尾猴。 此外,還在4 份NHPs 血清標本中發現3 份特異性抗體陽性[7]。 隨后在13 只野生猴中發現4 只抗MPXV 特異性抗體陽性[8]。 1979 年,在剛果進行的大規模的血清抗體檢測顯示,在43 種動物包括嚙齒類、非人靈長類等動物中有2%～70%的抗OPXV 抗體陽性[5]。 1986 年剛果(金)北部的一項調查,發現39 只從原始森林捕獲的NHPs 中,3只長尾猴特異性抗體陽性[9]。 1988 年大規模的調查發現,在剛果(金)的兩個地區的NHPs(主要是紅尾長尾猴)中,7.8%的標本特異性抗體陽性[10]。 這些針對NHPs 的大規模的調查是50 年前WHO 為消滅天花而組織的國際合作的一部分,NHPs 的感染后來也有零星的報道。

2012 年科特迪瓦Ta? 國家公園一只死亡的野生白枕白眉猴(sooty mangabey,SM)幼體被發現,有典型皮疹。 檢測發現MPXV 陽性,皮膚、咽拭子、胸腺病毒載量非常高[11]。 2017 年該公園3 個相鄰黑猩猩群體出現猴痘疫情,發病的主要是幼齡個體,猩猩有呼吸道癥狀;分離出的3 個毒株與死亡的SM毒株的有非常近的遺傳距離[12]。 2014 年喀麥隆中部NHPs 收容所的黑猩猩暴發猴痘疫情。 72 只中至少6 只檢測出MPXV DNA 陽性。 2016 年黑猩猩再次發生疫情,同樣未找到傳染源[13]。

總之,MPXV 感染的NHPs 種類很多,包括多種猩猩[14]、新大陸猴;也包括舊大陸猴中常見的亞洲獼猴和非洲猴[1,15]。 在最近的暴發中,宿主或主要載體的身份仍未確定,NHPs 被認為只是偶然的宿主;這也可能是缺乏持續更新的血清調查數據。 基于動物倫理、動物保護和生物安全的考慮,現在已經不可能像當年研究天花一樣深入非洲叢林。

2.2 嚙齒類動物的自然感染

1970 年在人猴痘病例出現后,收集動物樣本的地理范圍縮小到剛果的熱帶雨林。 1985 年從西非松鼠體內分離出猴痘病毒,被捕獲的松鼠體表有明顯的皮疹[5]。 1986 年在剛果(金)的大規模調查發現,24.7%的西非松鼠、16.2%的紅腿太陽松鼠有特異性抗體;松鼠也是當地唯一一種常被人捕捉的動物[9]。 包含這項研究的更大規模的生態學調查發現23.7%非洲松鼠(屬)、14.9%的太陽松鼠(屬)特異性抗體陽性,而超1000 例其他嚙齒類與食蟲類則未檢出[10]。 1996～1997 年的調查發現,25%的野生動物(以松鼠為主)檢出抗OPXV 中和抗體。 病毒蝕斑減少中和抗體試驗顯示,剛果(金)一地區59只動物中15 只陽性,包括岡比亞頰囊鼠、四趾巖象鼩、西非松鼠、庫氏非洲松鼠、太陽松鼠等[16]。

2003 年美國發生猴痘疫情,傳染源被確定為運輸途中3 種從非洲進口的嚙齒類動物。 包括1 只岡比亞頰囊鼠、3 只非洲睡鼠和2 只繩松鼠;與岡比亞頰囊鼠密切接觸的(北美)草原犬鼠被感染并將病毒傳播給人類[2]。 盡管這些動物受到普遍關注,但2012～2015 年在剛果(金)捕獲的353 只動物中陽性率很低;僅7 只有抗OPXV 的IgG 陽性,種類包括非洲松鼠、紅腿太陽松鼠、扎伊爾頰囊鼠、扎伊爾睡鼠、四趾巖象鼩、褐鼻鼠[17]。 2017 年剛果(布)的調查發現,在嚙齒類105 只動物中僅2 只非洲巨頰囊鼠抗OPXV 的IgG 抗體陽性[18]。 2018 年調查發現,西非(主要是剛果)的猴痘疫源地與非洲松鼠屬的分布高度重疊,包括西非松鼠、高山非洲松鼠、庫氏非洲松鼠、飾紋非洲松鼠、紅足非洲松鼠等[19]。

非洲嚙齒動物被認為是最可能的宿主,既包括松鼠科的非洲松鼠(繩松鼠)、太陽松鼠,也包括其他嚙齒類動物如非洲睡鼠、岡比亞頰囊鼠、非洲跳鼠、非洲帚尾豪豬等;還包括其他非嚙齒類動物,如象鼩、非洲刺猬等。 除此之外,其他大洲的動物也能被病毒感染,如旱獺(Marmotabobak)、草原犬鼠、(美洲)負鼠、大食蟻獸等[1,15]。

3 猴痘病毒的隱性感染與顯性感染

3.1 猴痘病毒的隱性感染

動物的MKXV 自然感染,部分是隱性感染。1959 年美國賓夕法尼亞州默沙東實驗室的食蟹猴和恒河猴因為與非洲綠猴共用籠舍而感染,大約5%非洲綠猴被感染而沒有癥狀[2]。 1962 年,美國Walter-Reed 陸軍研究所報告27 只食蟹猴中3 只出現猴痘癥狀。 其余的食蟹猴、恒河猴、非洲綠猴群HI 抗體呈不同程度陽性[4]。 當時普遍接種天花疫苗,工作人員未見感染[4]。

野外的成年黑猩猩可以表現為隱性感染,既無癥狀也無皮疹,也有少數青少年或更小的黑猩猩表現為隱性感染[12],個別成年黑猩猩偶發咳嗽。 自然感染的非洲巨頰囊鼠也可以表現為隱性感染,外表無異常,僅性腺檢出病毒DNA,且抗體陽性[20]。

MPXV 的實驗性感染也可表現為隱性感染。 食蟹猴和某些新大陸猴在MPXV 滴鼻感染后無癥狀,而抗牛痘的HI 抗體陽性[6]。 岡比亞頰囊鼠滴鼻感染后沒有明顯臨床癥狀,病毒載量升高不明顯,體液可檢測到活病毒[21]。

隱性感染在非洲當地人群中廣泛存在。 如49.1%剛果(布)北部人群(≤25 歲)和37%的加納年輕人(＜23 歲)抗OPXV 抗體陽性。 更具有說服力的是針對喀麥隆黑猩猩收容所疫情的調查報告。在受訪的63 人中(未接種天花疫苗),4 人(1 個飼養員和3 個附近的村民)血清抗OPXV 抗體IgG 陽性而從未出現過猴痘癥狀[13]。

臨床病例也可見隱性感染。 有報道發現224 例臨床男性肛腸標本中3 例猴痘PCR 陽性。 他們在采樣前后的幾周內都沒有出現過任何癥狀。 采樣后21～37 d,標本檢測不到病毒DNA[22]。 98%的感染者是同性戀或雙性戀男性[23]的事實也說明非肛交途徑感染如呼吸道途徑、接吻等途徑感染極少出現癥狀,而表現為隱性感染。

3.2 猴痘病毒的顯性感染

嚙齒類動物一般表現為顯性感染。 這些敏感動物的種類很多,但只有部分感染后出現皮疹,如西非松鼠、草原犬鼠[24]、旱獺[25]、非洲巨頰囊鼠[21,26]等,其他動物感染后即使死亡也未見皮疹或者尚未發皮疹。 睡鼠、松鼠猴等多種動物感染后不一定出現皮疹[20]。

非人靈長類的顯性感染:NHPs 的顯性感染最經典案例是荷蘭鹿特丹動物園的疫情。 大食蟻獸首先發病,并出現典型癥狀后死亡,接著紅毛猩猩、黑猩猩、大猩猩、梟面長尾猴、亞洲獼猴、長臂猿、松鼠猴、狨被感染并出現類似皮疹。 半圈養的黑猩猩感染后食欲不振,前肢出現漸進性小皰和皮膚結節樣突起,并有1 只死亡[13]。 在野外,部分自然感染的幼齡黑猩猩發病,呼吸道癥狀明顯,如呼吸困難、咳嗽等;可伴發疹,而不一定是彌漫性的痘疹;但是成年個體一般無癥狀[12];病情與年齡相關的原因不明。 監測表明,該地區的MPXV 是突然出現的,這意味著成年個體不是因為長期在環境中接觸過該病毒的抗原而獲得了免疫力。

人類的顯性感染:人類的顯性感染至少有3 種類型。 第一類是典型的天花樣病變,如剛果(金)1970～1983 年的病例,有發疹、淋巴結腫大等體征,約60%的患者皮疹超過100 個。 這些癥狀、體征都無法與天花區分。 第二類是2003 年美國猴痘疫情,與患病的草原犬鼠的密切接觸者出現多種癥狀。非侵入性感染者病情較輕,相應癥狀和體征出現比例更少[27]。 復雜途徑感染者潛伏期更短,前驅期無發熱而直接出現皮疹,短暫的皮疹期之后有長的發熱期[27]。 第三類是非典型癥狀的猴痘感染,如2022 年新出現的肛交感染群體,其中包括部分人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者,這類感染者缺乏呼吸道病變癥狀,如咳嗽等,皮疹也很少,大部分人只有數個[23]。

4 猴痘病毒與HIV 的共感染

最近,同性戀和雙性戀群體因肛交(肛門直腸粘膜感染)而成為MPXV 感染的主要群體,該群體也是HIV 感染的高發群體。 大型病例分析發現,HIV 感染的猴痘患者比例很高。 英國26%的已知猴痘病例是HIV 感染者,而歐洲國家這一比例為37%;美國41%的MPXV 感染者同時也是HIV 感染者;西班牙的兩個大城市,40%感染者HIV 陽性[23]。

西非近年來出現的猴痘患者的死亡被認為與未經治療的HIV 感染有關。 尼日利亞40 名MPXV感染者中5 人死亡;合并HIV 的感染患者9 人,其中2 人死亡。 與MPXV 單感染相比,共感染患者病程更長,痘疹更大,繼發性細菌皮膚感染和生殖器潰瘍的比例更高[28];這與歐美的發病率有較大差距。 尼日利亞5 名共感染患者均有繼發性感染,而MPXV 單感染患者繼發性感染不到1/3,這說明這些共感染患者的病毒載量沒有得到控制,有免疫缺陷而無法控制感染,因此死亡風險較高。 歐美共感染患者的病毒載量控制在非常低的水平,CD4+T 細胞數量也大致在正常水平[23],這應該是歐美共感染極少出現死亡病例的原因。 最近幾年的調查也顯示,剛果(金)HIV 的實際上的感染率為11%,這遠超過先前的估計的2.86%[29]。 動物實驗也證實,SIV 感染的恒河猴進入艾滋病階段后即使用天花疫苗免疫,MPXV 攻毒的恒河猴也會很快死亡[30]。

還有部分非洲猴痘患者死亡與HIV-1 共感染無關,當地的猴痘病毒有較高的致病性。 尼日利亞MPXV 單感染患者中,3/31 死亡,3/5 的患者皮疹數在100 個以上[28]。 2003 年美國疫情患者中,約半數以上患者皮疹少于25 個[27],而2022 年的歐美同性戀群體中接近40%的患者皮疹不到5 個,且尚未出現死亡病例。 這說明非洲當地的猴痘感染的病情比其他地區更嚴重。

除了HIV,猴免疫缺陷病毒(SIV)可能是另外一種共感染的病原體。 喀麥隆的調查發現,獵人(高暴露群體)的SIV 陽性率為17.1%,而這些人同時也是猴痘的高發人群[31]。

非洲當地的NHP 也存在共感染。 西非和中非是SIV 的疫源地,SIV 的自然宿主主要是攜帶SIVsmm 的白枕白眉猴和攜帶SIVcpz 的黑猩猩,也包括非洲綠猴、疣猴和狒狒等。 另外,猴痘病毒宿主與SIV 靈長類自然宿主的種類與分布地域重合。

5 實驗性感染與動物模型

5.1 不同毒株的實驗性感染

WHO 將MPXV 分為兩個演化支。 包括剛果盆地支和西非支。 前者感染病死率約為10%,后者感染較輕,致死率低。 剛果支(中非支)可以繼續細分為Ⅰ～Ⅴ組[3]。 一種新的分類方法將剛果支命名為Clade 1,將西非支進一步分為Clade 2 和Clade 3;演化支Clade 3 基本上都是人源性毒株[32];也有分類方法直接將人人傳播的所有毒株歸屬于Calde 3[33]。

剛果株(Zr-599)比西非株(Liberia)病毒致病性更強。 從食蟹猴的實驗性感染看,不管是皮下注射還是滴鼻感染,剛果株感染后,猴呼吸道、泌尿生殖系統和胃腸道病變更嚴重,剛果株感染猴的血液病毒載量比利比里亞株高約10 倍。 剛果株感染比西非株有更多的皮疹數量和更嚴重的潰瘍性病灶[34]。

小鼠(CAST/EiJ)的滴鼻的實驗發現,剛果株(Z79-CB2)感染的存活率更低,10 PFU 腹腔注射可導致半數死亡,但動物體重并未見下降;滴鼻感染時,半數致死劑量(LD50)比西非株感染至少低一個數量級。 剛果株滴鼻感染的小鼠以肺組織病毒滴度最高,達109PFU/g,肝、脾的病毒滴度明顯偏低;腹腔注射時,脾、肝、肺病毒載量都很高,而脾最高。西非株(USA-C1)滴鼻感染時,感染劑量達到104時才出現半數死亡率。 肺、卵巢、脾都有較高滴度病毒;感染劑量與組織中的病毒滴度峰值缺乏相關性[35]。 這說明不同毒株在小鼠組織器官中增殖與感染途徑和劑量有關。

最近發現,加拿大的分離株Clade 1(剛果株V79-1)和Clade 2(西非株SP2833)對CAST/EiJ 并未顯示強的致病性,甚至104PFU 滴鼻感染未見死亡[36],這說明該小鼠模型還有進一步優化的必要。

5.2 嚙齒類的實驗性感染與動物模型

豚鼠、倉鼠對MPXV 不敏感,無皮疹,實驗性感染無死亡。 成年兔和成年大白鼠感染后不易死亡,但幼齡的兔和大鼠很易死亡。 棉鼠、歐亞紅松鼠、非洲松鼠、十三紋地松鼠、草原犬鼠、CAST/EiJ 小鼠、睡鼠均非常敏感,攻毒易導致死亡。 死亡也與感染途徑有關,如小鼠、草原犬鼠滴鼻感染的死亡率比靜脈注射的死亡率少50%[24]。

旱獺模型:旱獺低劑量滴鼻感染顯示,病毒首先在氣管、肺組織復制,然后是鼻甲、結腸、皮膚等處。 中高劑量皮下注射感染時,除了氣管、支氣管和肺,皮疹、鼻粘膜、睪丸/卵巢、腹股溝淋巴結、腎、腦等組織器官病毒滴度也很高[25]。 肝并未檢出高滴度的病毒,這有別于草原犬鼠等其他動物。 睪丸與腦組織中檢出一定量的病毒,這說明病毒能通過腦屏障和血睪屏障,可能出現神經病變。 實際上旱獺容易出現生殖系統病變。 兩種不同劑量的攻毒實驗發現,在多種組織器官中,睪丸甚至與皮疹有同樣高的病毒滴度[25]。 這與同為地松鼠族的草原犬鼠有較大差異。 天花疫苗免疫過的旱獺能預防MPXV 感染的動物發病,而未免疫組全部動物發病,半數動物死亡。 這說明旱獺合適作為猴痘疫苗有效性評價的模式動物[25]。

草原犬鼠模型:野外捕捉的黑尾草原犬鼠在熒光素酶基因的重組病毒(西非株USA-2003)腹腔注射(105.1PFU)感染后,所有動物在11 d 內全部死亡。 尸檢發現,肝、脾、肺、腎的病毒滴度較高。 病理染色可見肝、脾有小灶性壞死,肺內輕度炎性改變。 滴鼻途徑感染的主要病理改變在肺和胸膜腔;因為胸膜腔纖維素滲出而有胸膜和肺的輕度粘連。3/5 的動物死亡,死亡動物中,僅1 只肺檢出高滴度病毒。 動物的嘴唇、舌和頰黏膜上也有潰瘍性改變[37]。 腹腔注射與滴鼻感染的死亡率和生存時間差異較大,這說明感染部位或攻毒方式對感染結局影響較大。 通過活體成像技術檢測動物的病毒載量也是一種非常直觀的方法,如用熒光素酶基因的重組MPXV(西非株)和野生型毒株(5×104PFU)滴鼻感染(德克薩斯州)野外捕捉的黑尾草原犬鼠。該方法的局限性是組織器官的病毒量檢測需要離體標本。 感染第6 天,肝的熒光強度最高,個別腸段、下頜淋巴結熒光強度較高,心、肺較低;感染第9天病毒載量較低。 感染后6～17 d,皮疹的病毒滴度最高,其次是舌;其他組織如鼻甲和頜下淋巴結也較高[38]。

免疫組化染色發現,病毒抗原在有皮疹、舌鱗狀上皮細胞和細支氣管粘膜上皮細胞質中含量很豐富[39]。 局部病毒富集引起了組織病變,如水腫、滲出、壞死,出現了膿皰、潰瘍。

十三紋地松鼠(學名多紋黃鼠)在105.1PFU(USA-03 毒株)腹腔注射和滴鼻途徑后,所有動物都出現暴發性感染,并在感染后6 ～9 d 后死亡,腹腔注射比滴鼻感染生存時間更短。 死亡前數天的血液和口咽分泌物可通過培養分離到活病毒;尸檢發現器官的病毒滴度從高到低依次為肝、脾、肺、腎、心、腦;但兩種途徑感染后組織器官的病毒載量幾乎無差異。 肝、脾病毒抗原陽性表達明顯,HE 染色可見明顯肺間質增寬[40]。 肺間質增寬是病毒性肺炎的病理改變,是呼吸系統應該關注的病變類型。

西非松鼠模型:剛果(金)當地的西非松鼠用熒光素酶標記的MKXV 剛果株用106PFU 滴鼻感染后,排毒以口腔拭子滴度最高,鼻拭子樣滴度稍低;肛門排毒持續時間最短。 皮內感染后,口拭子、肛拭子病毒滴度峰值稍高于眼、鼻拭子;口、鼻、眼的排毒持續時間基本相同。 兩者比較,滴鼻感染的體外排毒期短,而病毒滴度峰值稍高。 從體內病毒復制看,滴鼻途徑的熒光強度稍高,而兩者病毒增殖的趨勢基本相同。 總體上,滴鼻組3/4 的動物死亡,皮內組2/4 的動物死亡;但取材后僅在唇、舌、皮疹等處檢測到高病毒載量[41]。 這對于猴痘感染疑似人群的篩查有指導意義。

岡比亞頰囊鼠模型:美國佛羅里達州野外捕捉的岡比亞頰囊鼠,用帶熒光素酶的重組病毒(中非株)106PFU 經皮內注射感染,通過熒光值估計病毒載量,3 只動物病毒載量在第8 ～14 天達到峰值,21 d 后恢復到背景水平。 病鼠可見角膜炎、牙齦炎;皮膚有突起,但無潰瘍[21]。 同樣地點捕捉的岡比亞頰囊鼠(或為扎伊爾頰囊鼠)用剛果株和西非株(4×104PFU)皮下接種后,體溫顯著升高,活動減少,體重下降。 西非株感染后病毒載量最高的組織是腸系膜淋巴結,其次是接皮膚接種點;其他組織器官如皮膚、脾、腎、心、肺、肝等病毒載量也較高。 皮膚、舌面可見皮疹,但不同毒株組未見差異。 總體上,西非株感染組排毒量更高,口腔拭子的病毒載量峰值比鼻拭子高2 個數量級以上,肛拭子載量最低。 剛果株感染后排毒非常早,無死亡。 兩毒株活病毒排毒持續時間基本相同,但拭子PCR 檢測發現,西非株的陽性持續時間更長[26]。

非洲睡鼠模型:非洲睡鼠對MPXV 十分敏感,5 PFU 滴鼻即可導致20%的死亡[35];還有研究顯示2 PFU 滴鼻感染即可引起＞1/3 的睡鼠死亡。 104PFU滴鼻感染后組織器官的病毒滴度在2 ～5 d 內逐漸升高;滴度最高的是肝,其次是脾和肺,再次為鼻洗液和血液。 睡鼠感染后可見消瘦和結膜炎、鼻黏膜壞死性炎,未見皮疹;但內臟病變十分明顯。 病變包括壞死性改變,如呼吸道黏膜柱狀上皮細胞層壞死、肝內點狀壞死、淋巴結與脾中淋巴細胞減少,特別是部分淋巴結中淋巴細胞明顯減少;還可見出血性改變,如腦出血、膽管的粘膜下出血[42]。 非洲睡鼠在低劑量滴鼻感染帶熒光素酶的重組病毒后,活體成像顯示睡鼠腹部、口鼻部和胸部熒光強度非常高;組織器官中肝的病毒滴度最高(＞109PFU);其次為脾、肺、鼻甲等,而卵巢載量較低[43]。 自然感染的睡鼠,病毒載量最高的器官也是肝,其次為脾和肺[20]。 總之,非洲睡鼠滴鼻感染MPXV 后,肝的病毒載量[20]或滴度最高[42-43],其滴度甚至明顯高于其他器官[42]。 非洲睡鼠自然感染的途徑不明,氣溶膠吸入、唾液吞食或抓咬傷等都有可能。 用該模型檢驗天花疫苗Dryvax 或藥物Cidofovir 的有效性,發現Cidofovir 能明顯降低滴鼻感染的死亡率,而Dryvax 接種對猴痘也有很好的保護效果[42]。

小鼠模型:小鼠屬各品種、品系對MPXV 敏感性的差異非常大。 常見的近交系小鼠BALB/c 和C57BL/6 對MPXV 有很強的抵抗力;而野生近交系小鼠,如CAST/EiJ、MOLF/EiJ、PERA/EiJ 等在低劑量MPXV 剛果株感染后會發病并死亡。 CAST/EiJ小鼠的腹腔注射感染比滴鼻感染病變更嚴重,半數致死量(LD50)更小。 腹腔注射(104PFU)感染的小鼠脾、肝、肺病毒滴度都高,而滴鼻感染的肺病毒滴度很高,其他器官較低[35];另一實驗也證實,CAST/EiJ 小鼠滴鼻感染(2×104～2×105PFU)Z06 毒株后,病毒主要聚集在口鼻部位,內臟中肺的病毒滴度最高,其他組織如肝、脾、腦、卵巢病毒載量比肺低兩個數量級以上[43]。 CAST/EiJ 小鼠滴鼻感染(102～106PFU)Z79 毒株后,組織器官的病毒滴度以肺為最高,明顯高于肝、脾、腦、腎等,另外肺病毒滴度持續時間也更長[44]。

CAST/EiJ 小鼠模型也被用于藥物的有效性評價,如細胞因子IL-15 注射被證實對MPXV 的腹腔感染有明顯的保護作用[45]。 也有研究表明,CAST/EiJ 對MPXV 并不是很敏感,104PFU 的病毒滴鼻感染后,小鼠無死亡[36]。 病毒在小鼠呼吸道中能有效復制,每日口服TPOXX 治療可顯著降低感染后1 周和2 周組織中的病毒滴度[36]。 另外,干擾素及其受體基因缺陷,如C57BL/6 小鼠IFNγ和IFNγR基因缺失在一定程度上影響感染的結局[44]。 干擾素通路相關基因缺失也會影響感染結局,如C57BL/6stat1-/-小鼠,相對低劑量的鼻內感染后10 d 內全部死亡,而C57BL/6 小鼠用更高劑量感染也不死亡?；蛉毕輰Σ《靖腥镜挠绊戇€與動物背景有關,如剛果株滴鼻感染,C57BL/6stat1-/-比129stat1-/-小鼠病變更嚴重,甚至出現神經病變。 免疫缺陷小鼠SCID 比IFN-α/βR-/-和IFN-γR-/-小鼠更敏感,低劑量滴鼻也會出現死亡[46]。 總體上,體重變化和死亡率等與毒株、感染劑量和感染途徑有關。

BALB/c 小鼠對MPXV 不敏感,滴鼻感染時病毒復制主要局限于肺部[44],可以用作輕癥模型。

總之,動物種類、感染方式和感染劑量對病毒的組織嗜性有較大影響。 滴鼻途徑感染時,病毒更傾向于在肺組織中復制。 對草原犬鼠、十三紋地松鼠和非洲睡鼠而言,MPXV 有更明顯的嗜肝性,這可能是這些動物比其他敏感動物更容易死亡的原因。

5.3 非人靈長類的實驗性感染與動物模型

黑猩猩對天花病毒很敏感,是理想的模式動物。 后來發現黑猩猩對猴痘病毒也很敏感,黑猩猩也因此一度作為猴痘的模式動物。

美洲的普通狨(Callithrixjacchus)對猴痘病毒也十分敏感,病毒血癥出現早。 狨猴模型與睡鼠模型均有嚴重的出血癥狀,與出血型天花類似。 極低劑量即可導致動物死亡,因此是非常合適的重癥感染模型[47]。

食蟹猴與恒河猴是抗猴痘病毒藥物與疫苗有效性評價最常用的模式動物。 與黑猩猩和狨猴相比,這兩種舊大陸猴對MPXV 的相對不敏感性,但中高劑量病毒感染后也會導致動物死亡[2]。 氣溶膠霧化吸入感染實驗猴是最常用的方法之一,在以前被認為是最接近人類自然感染的攻毒方法,靜脈注射病毒也是較常用的方法,但不是自然感染。 氣管內滴注也是一種模擬自然感染的方法,病毒液會進入某個肺葉,這樣可能會出現某個肺葉病變嚴重而其他肺葉病變輕或無病變的情況。 還有一種支氣管鏡深入支氣管分叉處噴霧的方法,有別于普通的氣管內滴注[48]。 同樣劑量的病毒通過呼吸道途徑感染時,感染方式不同(如氣溶膠、氣管內滴注、支氣管內滴注、經支氣管噴霧等),實驗猴的癥狀、體征、病毒血癥持續時間及生存時間也會有一定差異。 這些也因動物種類不同而有所差異,如食蟹猴與恒河猴靜脈注射相同劑量剛果株(Z79),恒河猴血中病毒載量出現更早,而皮疹和死亡出現稍晚[2]。 食蟹猴感染后血液的病毒載量呈一過性升高,然后回落到基線,沒有平臺期。 攻毒劑大時動物容易死亡,而血液病毒載量過高也容易導致動物死亡,但病猴死亡時血液病毒載量不一定很高[48]。

食蟹猴在氣溶膠感染后的大體病變以肺/支氣管炎、皮疹及口腔、舌黏膜炎癥為主,鏡下病變以呼吸系統(包括氣管/支氣管、肺、咽喉等)和淋巴結炎性改變為主,少見肝受累[49]。 支氣管噴霧攻毒(Zr-79)可以導致部分食蟹猴死亡。 病肺離體后保持膨脹狀態。 鏡下呈小葉性肺炎改變,細小支氣管內有大量炎性壞死性物質,伴肺水腫,管腔周邊肺泡中可見大量液體滲出,這可以導致肺泡喪失氣體交換功能。 此外還可見肺充血和肺間質增寬,偶見腎小球血栓形成[48]。 另一項實驗顯示不同的感染途徑結果差異較大。 皮下感染比滴鼻感染病變更重,剛果株(Zr-599)皮下感染后組織器官普遍有病毒增殖,甚至胃粘膜表面也出現密集痘疹,而滴鼻感染后病變以淋巴結、皮疹為主。 皮下感染比滴鼻感染的猴進食更少,體重減少更多,體溫升高、病毒載量更高、急性期蛋白水平更高,總之,后果更嚴重[34]。

氣溶膠實驗性感染的食蟹猴,免疫組化染色可見病毒抗原集中在鱗狀上皮層表達,與周圍組織界限分明,或在細支氣管上皮細胞,其他管周細胞與滲出的炎性細胞也有表達。 食蟹猴呼吸道感染的動物,下呼吸道上皮是原發性感染的主要靶點之一[48-49]。 不同巨噬細胞與單核細胞、DC 細胞有陽性表達。 隨著病程延長,病毒會隨細胞從基底層遷移到更淺的鱗狀上皮層,淋巴結皮質也有表達[49]。

食蟹猴氣管內或者靜脈途徑感染Z79 后,急性期睪丸組織可見出炎癥和壞死,睪丸間質細胞、精管和附睪管腔中檢測到MPXV。 在恢復期,病毒已從大多數組織器官中清除,但睪丸中依然可以檢測到病毒,病毒滯留時間長達37 d。 這說明MPXV 通過性途徑傳播的可能性是很大的[50]。

5.4 當前動物模型的問題

盡管敏感的動物很多,但理想的模式動物依然很少。 現有的模式動物主要是松鼠科,體型偏大,使用很少,也非SFP 級實驗動物。 現有的模型中,小鼠模型非常少,這不利于猴痘的動物實驗開展。

現在已經有多種感染途徑的動物模型,但是缺乏模擬近階段人類自然途徑感染的動物模型,如肛門、直腸途徑甚至口咽途徑(口交)感染的動物模型。 由于部分感染者是雙性戀,女性可能通過性途徑感染,包括生殖道黏膜的局部感染與上行感染,如陰道、宮頸、子宮甚至卵巢的急性炎癥,因此需要建立經生殖道感染的動物模型。 現有病人中,HIV感染者占很大比例,因此需要利用免疫缺陷小鼠建立猴痘動物模型,如SCID 小鼠、裸鼠、NSG 小鼠。

現有的動物模型以重癥模型為主,發病動物的體征與癥狀非常明顯,但是現階段的猴痘病例中,嚴重病例非常少。 因此,有必要建立輕癥的動物模型或者隱性感染的動物模型。 現有的動物模型一般使用成年動物,缺少嬰幼個體等未成年動物模型,同時也缺少母嬰傳播的動物模型。

6 結語

猴痘疫情的暴發的原因是復雜的。 除了常見的當地的叢林捕獵、叢林動物肉類交易和林地墾殖;也有我們忽略的原因,如叢林生態游、高端狩獵等;還有不為人知原因,如野生動物活體的非法貿易、飼養與肉類走私[14]。

構建動物模型是非常必要的,如氣溶膠/飛沫等呼吸道途徑感染的模擬;孕婦感染后垂直傳播模型的驗證;抗猴痘疫苗與藥物的有效性和安全性的評價;猴痘包括相關合并癥、并發癥等治療方案的優化。 構建不同病變程度的動物模型,如輕癥模型、重癥模型,不同組織器官的損傷模型,如呼吸道病變模型、肛腸粘膜病變模型和神經病變模型也是非常必要的。

構建動物模型也是非常緊迫的。 MPXV 的暴發呈現新的特點,可能再次暴發并廣泛傳播,可能會發生重組與變異,出現高致病性毒株的流行。 雖然猴痘病毒感的體征不嚴重,但患者主觀上感受到劇烈持久的疼痛。 這嚴重影響了患者的生活質量,也違背了生命倫理。 因此我們應該及時構建動物模型控制這種疾病。

建議與措施:應盡快構建適合當前疫情的動物模型,特別是肛腸途徑感染的動物模型和免疫功能缺陷的動物模型;應盡快構建適合抗猴痘疫苗與藥物評價的動物模型,特別是殺精劑、抗病毒凝膠等外用藥物;應盡快構建簡便實用的小動物模型,特別是小鼠模型。 2022 年6 月,中國實驗動物學會的第一屆猴痘病毒在線學術沙龍呼吁從5 個方面應對猴痘病毒的流行,包括加強基礎研究、研發疫苗、加強生物安全管理、對公眾普及猴痘的科學知識、加強國際合作等[51]。 生物安全專家魏強教授也對此給出了類似的更詳細的建議[52]。

人類、動物與自然環境是一個利害關聯的整體,并擁有一個共同的命運。 MPXV 的傳播不是一個孤立的事件,而是一個危害這一整體健康(One Health)的人獸共患病,因此我們應加強合作與聯系,共同應對這種流行[53]。 截至2023 年6 月,中國內地新增猴痘確診病例達106 例。 這存在大流行的可能性,已經構成了嚴重的公共衛生問題[54]。 用不同種類的動物,建立感染與疾病模型,或者建立不同感染途徑的動物模型、不同病變類型的動物模型或者不同毒株感染的動物模型是非常必要的,這可以更深入的研究猴痘的致病特點,更有利于預防與治療猴痘病毒的感染,更有利于人類衛生健康共同體的構建。