CREB 通過調節突觸可塑性調節記憶及與阿爾茨海默病的聯系

羅卓慧龐 碩張連峰

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021;2.中國醫學科學院神經科學中心,北京 100730)

環腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)是堿性區亮氨酸拉鏈(basic region-leucine zipper,bZIP)轉錄因子超家族的重要成員之一,定位于細胞核內,在腦組織的各種細胞中廣泛表達。 CREB 基因與環腺苷酸反應元件調制器 ( cAMPresponsiveelement-binding modulator,CREM)和激活轉錄因子-1(activating transcription factor-1,AIF-1)兩個同源基因共同構成CREB 轉錄因子家族[1]。 作為一種重要的轉錄因子,CREB 參與調節鈣、神經營養因子、細胞因子信號通路以及各種細胞應激信號通路,通過調節神經元相關蛋白的表達調控單個神經元及整體神經通路的功能,主要調節分化、生存和可塑性,影響學習記憶,并與帕金森癥、精神分裂癥、酒精依賴、抑郁、焦慮等多種神經精神疾病的發生發展密切相關[1]。

1 CREB 的結構與激活

CREB 蛋白的主要結構域包括Q1 區、激酶誘導結構域(KID)區、Q2/CAD 區和亮氨酸拉鏈結構域(bZIP)區4 個區域。 位于蛋白C 端的基本結構域介導CREB 與DNA 結合,Q1 和Q2/CAD 兩個結構域含有豐富的谷氨酰胺,bZIP 區介導與DNA 的結合和二聚化,其他的區域促進CREB 與激活子或轉錄復合物結合。 KID 區的Ser-133 殘基磷酸化后與轉錄激活子CREB 結合蛋白(CREB binding protein,CBP)結合,在內在或相關的乙?；D移酶的作用下CREB 與核心轉錄機器相互作用誘導轉錄進行,該過程可持續數小時[2],Ser-133 位點是CREB 激活的標志,研究發現Ser-133 位點激活的CREB 對轉錄調控,繼而調節基礎神經傳輸,突觸可塑性和空間認知發揮了不可或缺的作用。 CREB S133A 突變小鼠在空間認知,神經傳輸和神經電位等方面表現出明顯的缺陷[3],而Ser-142 位點磷酸化后促進CREB二聚體解聚,抑制轉錄[4]。 回文序列“TGACGTCA”是cAMP 反應元件,可被CREB 特異性識別。 不同物種的CRE 序列存在差異,但“CGTCA”序列相對保守[1]。

興奮性神經遞質、神經生長因子、G 糖蛋白偶聯受體(G-PCRs)配體和壓力等可激活CREB 的磷酸化,常見的激活CREB 磷酸化的通路按來源可分為cAMP 信號通路、鈣離子信號通路、生長因子誘導和壓力誘導的信號通路,包括Ca/CaM/CaMK/CREB、GPCRs/AC/cAMP/PKA/CREB、 RTK/Ras/ERK/RSK/CREB 和RTK/PI3K/AKT/CREB 信號通路等[2],近年來又發現PPARα/CREB[5-6]和CCR5/CREB 通路[7]。 蛋白磷酸酶(protein phosphatase 1,PP1)是CREB 最主要的磷酸酶,抑制CREB 活性[1,4]。 除磷酸化修飾外,研究發現CREB 還存在糖基化修飾,阻斷CREB 的糖基化可增強神經元軸突和樹突生長,促進長期記憶鞏固[8]。

CREB 是轉錄因子網絡的重要組成部分,CREB介導的轉錄受轉錄激活子和抑制子共同調節,CREB的轉錄激活子包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、CREB 調控的轉錄輔激活因子(CREB regulated transcription activator 1, CRTC1)和CREB結合蛋白(CREB binding protein, CBP)。 AP-1 是亮氨酸拉鏈蛋白Fos 和Jun 的異二聚體,通過調節CREB 的轉錄水平調節突觸強度和突觸數目間接調節突觸可塑性,CREB 又可正反饋調節AP-1 的表達[9]。 靜息狀態下神經元中的CRTC1 定位于突觸上,在局部刺激下CRTC1 被鈣流或鈣調磷酸酶激活,迅速轉移至核內,與喂食狀態感應核受體(fedstate sensing nuclear receptor, FXR) 競爭性結合CREB[10]。 CRTC1 的核內表達受cAMP 調節[11],CRTC1 與CREB 的bZIP 區結合,促進CREB 與DNA 二聚化結合可激活CREB 的非磷酸化狀態[12]。CBP/p300 具有組蛋白乙酰轉移酶活性,與CREB 的KID 區結合并與和Ser133 位點相互作用[12],通過招募p53、ATF-1、ATF-2、junB、c-myc、E2F、c-jun 等轉錄因子介導轉錄[13]。

2 CREB 的下游目標基因

CREB 被多種信號通路激活后,可在T 細胞、肝細胞和精母細胞的分化等長期適應過程中發揮作用。 已確定的CREB 目標基因超過100 種,這些基因在結構上含有一個或多個CREB 結合位點,影響核轉錄、信號轉導、神經傳輸、代謝、細胞增殖與生長、細胞結構等方面[2,14]。

CREB 可通過調節下游基因調節突觸可塑性。一方面,CREB 可激活一系列突觸可塑性相關基因包括BDNF、NGF、tPA、Arc、PPARGC1、PLCγ、VGF等[15]。 BDNF 和NGF 是神經營養因子,在發育過程中支持神經元和神經突生長,共同調節細胞凋亡、細胞連接、纖維引導和突觸形態。 BDNF 在海馬體中指導神經發生,在突觸前和突觸后位置發揮旁分泌因子和自分泌因子的作用,促進血清素和多巴胺的傳遞。 體內和體外研究發現BDNF 可促進神經遞質釋放,突觸傳輸和LTP[16]。 作為一種神經保護因子,BDNF 對許多神經和精神疾病都具有治療潛力[17]。 BDNF 調節中樞神經系統的發育與可塑性,在LTP 中通過增加突觸囊泡的釋放調節突觸的結構和功能,表現為長期調節作用[18]。 NGF 通過調節膽堿能系統調節LTP[19]。 tPA 是細胞外絲氨酸蛋白酶,促進纖溶酶原轉化為纖溶酶,纖溶酶可降解部分細胞外基質,通過調節谷氨酸受體增加谷氨酸誘導的鈣離子內流,增加PKA 活性[18]。 Arc 是一種立早基因(immediately early genes, IEG),通過調節AMPA 型谷氨酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazopropionic acid receptor,AMPAR)的轉運和細胞骨架調控突觸強度[20]。 線粒體定位于神經元軸突末梢和樹突,是真核細胞內的負責能量供給和鈣緩沖細胞器,調節鈣和氧化還原信號,與LTP 的發生與維持密切相關[21],PPARGC1 是調節線粒體融合的重要基因,促進形成緩慢的氧化纖維,影響線粒體發生和突觸形成[21]。 PLCγ 通過被TrkB 招募,激活下游突觸可塑性信號通路,主要維持海馬內樹突形態與棘突收縮功能[21-23],VGF 是一種分泌多肽,在神經細胞和神經內分泌細胞中均表達,定位于胞體與突觸內,劑量依賴性增加突觸電位[24]。

另一方面,許多目標基因自身就是轉錄因子,如C/EBPβ、Egr1、Nurr1 等,這些基因對神經功能表現為間接調節作用[14]。

3 CREB 通過調節突觸可塑性調控記憶

突觸可塑性是中樞神經系統參與感知、學習和記憶的細胞基礎[25-27],突觸前膜釋放神經遞質觸發突觸后膜的能力稱為突觸效能,受到刺激時突觸效能的變化稱為突觸可塑性[27],常見的突觸刺激包括學習記憶、環境變化和腦損傷[28]。 突觸可塑性改變時,突觸前后的神經傳輸和膜轉運情況均改變,相關蛋白合成或激活,細胞骨架重塑,突觸可塑性在神經元層面上表現為突觸發生和棘突生長[28],在電位上表現為長時程增強(long-term potential,LTP)和長時程抑制(long-term depression,LTD)兩種。 LTP和LTD 的誘導,表達和相互作用依賴相關突觸蛋白基因的轉錄與翻譯和樹突骨架的重塑[29]。 按照突觸效能變化的持續時間突觸可塑性可分為短期突觸可塑性(持續幾毫秒至幾分鐘)和長期突觸可塑性(持續超過幾十分鐘)[27]。 突觸效能變化的第一階段細胞內僅對現有的蛋白進行修飾,第二階段轉錄并合成新的蛋白[30]。

記憶是重要的神經活動,包括短期記憶和長期記憶兩種,短期記憶立即形成,長期記憶形成緩慢但是相對短期記憶更穩固,需要合成相關mRNA 和蛋白質[31]。 記憶在海馬區中的形成,在大腦皮層中的鞏固,在記憶形成的不同階段突觸可塑性發揮的作用表現為時空特異性[32]。 研究發現與青年的對照組小鼠相比老年小鼠突觸可塑性明顯下降,樹突的棘突數目減少,生物反應路徑分析(ingenuity pathway analysis, IPA)結果表明CREB 在該突觸可塑性神經網絡中占據中心位置,相比青年對照組小鼠,老年小鼠CREB 的表達明顯下調[33]。 由反義寡核苷酸,RNA 干擾和基因突變等導致CREB 表達下調時,將導致記憶缺陷,影響回憶功能。 相反,CREB表達增加時,記憶增強[34]。

CREB 通過調節突觸可塑性調節記憶,主要影響長期記憶。 研究發現抑制海馬CA1 區CREB 轉錄因子家族基因后,與對照組相比小鼠短期記憶無明顯差異,長期記憶和空間記憶受損[31]。 CREB 已被證明是參與小鼠、大鼠、海兔、果蠅等多種動物長期記憶的重要轉錄因子[18],CREB 對突觸可塑性的調節作用表現在以下幾個方面:(1)影響離子流,CREB 激活后調控電壓門控Na+-K+通道的開放,鈉離子流增加,鉀離子流減少。 (2)影響遞質釋放,CREB 激活后突觸前膜神經遞質的釋放增加,突觸效能增加[35]。 (3)影響神經元興奮性,研究發現相比野生型細胞相同強度的電脈沖在CREB 過表達細胞引發更高的動作電位及更低的動作電位后超極化,CREB 激活后海馬區謝氏側支神經元L-LTP 增加[36],神經元興奮性增加,海馬CA1 區神經元產生L-LTP 所需要的刺激閾值降低[18]。 (4)影響樹突的棘突形成,抑制CREB 后棘突數目減少[18]。 (5)影響與可塑性相關基因的轉錄,進而調控相關生理過程[18]。 CREB 通過調節固有神經元的興奮性的影響神經元進入記憶軌跡的可能性,增加IEG 的表達,促進記憶相關基因的轉錄,實現對記憶的分配與調控[34,37]。 當環境發生變化時,CREB 參與皮層的軀體感覺和運動通路的重新投射,增加軸突數目和神經元棘突數目,誘導回路中新連接的形成,在腦卒中恢復中發揮重要作用[38]。

4 CREB 與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的關系

研究發現CREB 不僅調控許多神經可塑性相關基因的轉錄,還調控AD 相關蛋白的表達。 受CREB調控的淀粉樣前體蛋白胞內結構域相關蛋白(ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1B,AIDA-1)主要分布在突觸后密度區域(post synaptic density,PSD)。 AIDA-1 基因的轉錄受CREB 調控[39],是遲發型AD 的候選風險基因[40]。一方面,AIDA-1 通過下調γ-分泌酶降低Aβ 分泌,降低Aβ 含量[39],另一方面,AIDA-1 是突觸后密度蛋白(discs large MAGUK scaffold protein 4,PSD95)/N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)復合物的結合蛋白,在NMDAR 介導的突觸傳輸和可塑性中必不可少,AIDA-1 失活導致海馬依賴的突觸傳輸缺陷,AIDA-1 基因敲除小鼠活動性增加,前脈沖抑制,出現刻板行為[40]。

AD 患者表現出嚴重的認知和記憶惡化[41],突觸可塑性損傷, 神經元內神經纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs),胞外淀粉樣蛋白(βamyloid,Aβ)沉積和神經元大量死亡,海馬CA1 和CA3 區椎體神經元密度降低和神經元樹突棘密度降低是AD 早期的重要病理表型之一,這些突觸異常是由可溶性Aβ 寡聚體(Aβ oligomers,AβOs)積聚和 過 度 磷 酸 化 的 微 管 相 關 蛋 白 tau( hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau,HPtau)引起[29]。 AβOs 與突觸后膜的NMDAR 結合,誘導谷氨酸興奮毒性,擾亂谷氨酸再攝取及表面AMPAR 的去除,導致線粒體損傷,氧化應激和鈣離子穩態失衡,產生的突觸毒性最終導致細胞死亡[42]。 以Tg2576、PDAPP、APP/PS1、J20、3×Tg、5×FAD 為代表的AD 轉基因小鼠模型表現出明顯的突觸可塑性損傷,LTP 受損[43]。 Tau 通過調控微管結合域與微管蛋白的結合調控微管動力學,Tau 異常時抑制神經元生長和軸突延伸,微管密度降低,HPtau 從微管上解離,形成神經纖維纏結,損害正常的樹突結構[44]。 AD 患者腦內CREB 和磷酸化的CREB(phosphorylated CREB,P-CREB)的表達均下降[45],AD 常見動物模型APP/PS1 小鼠3 月齡P-CREB 明顯下調[46],3×Tg 小鼠CREB 和P-CREB表達明顯下降[47]。 Aβ 病理假說是AD 重要的病理假說之一,體外研究發現Aβ42誘導的神經元PCREB 表達下降[45,47],AβOs 誘導的神經元P-CREB表達下降[13]。 Aβ 通過下調NO/cGMP/cGK/CREB通路損傷突觸可塑性,影響學習記憶功能[48]。

CREB 與AD 聯系密切,且AD 表現的突觸可塑性損傷先于Aβ 沉積和NFTs 病理表型出現,可能是可逆的[29],因此CREB 可能是AD 潛在的治療靶點之一。 某些磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制劑和乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor,AChEI)已被發現可通過維持或激活CREB的Ser-133 位點磷酸化改善認知功能。 PDE 的主要功能是水解cAMP 和cGMP。 部分PDE 抑制劑通過促進抑制PDE,提高cAMP 和cGMP 的含量,激活CREB 進而改善長期記憶缺陷和認知障礙[49]。PDE4 抑制劑羅利普蘭在APP/PS1 小鼠中通過激活cAMP/PKA/CREB 通路,改善LTP 缺陷,改善條件性學習和長期空間學習記憶[50]。 在高脂飲食和低劑量四氮唑誘導的SD 大鼠糖尿病認知缺陷模型中,羅利普蘭可改善長期的空間記憶,提高P-CREB和突觸相關蛋白BDNF、ARC 的表達[53]。 研究發現衰老后PDE5 抑制劑(PDE5 inhibitors,PDE5Is)的活性和表達增加[48]。 以米羅那非為代表的PDE5Is 通過激活cGMP/PKG/CREB 通路增加LTP,減少細胞凋亡,HPtau 和Aβ 表型,改善認知功能[48,52]。 除PDE 抑制劑外,阿司匹林已被證明可與PPARα 結合,在5×FAD 小鼠中通過激活PPARα/CREB 通路激活鈣離子內流,加強下游BDNF,PSD95 和NR2A的表達,增加棘突的數目和密度[5]。 組胺H3 受體(H3 receptor,H3R)抑制劑塞普酰胺可通過激活CREB 介導的自噬途徑和溶酶體途徑,減少APP/PS1 小鼠缺血性損傷和神經元損傷,改善認知功能,在原代細胞模型可明顯改善Aβ 病理表型[53]。 三環類抗抑郁藥地昔帕明在AD 大鼠中通過上調PCREB 改善認知障礙[42]。 糖皮質激素受體抑制劑米非司酮可改善3×Tg 小鼠的認知缺陷,減少營養不良的神經突數目,改善Aβ 和HPtau 病理表型,并上調CREB 和P-CREB 的表達[47]。

5 結果和展望

現有的抗AD 藥物包括AChEI(多奈哌齊、利伐斯的明、加蘭他敏),NMDAR 抑制劑(美金剛)和基于Aβ 病理表型的藥物阿杜那單抗。 以上藥物可緩解AD 癥狀,已被批準上市,但目前沒有藥物可徹底延緩AD 的發病進程。 現有的AD 治療措施不足,AD 發生發展機制依舊不明,發現更多有潛力的AD靶點,并針對特定的靶點進行藥物研發,是AD 治療的研究方向之一。 CREB 是與突觸可塑性密切相關的蛋白,AD 患者CREB 表達和活性均抑制,表現出明顯的記憶缺失,認知缺陷和突觸可塑性損傷。 本文總結CREB 的結構與功能,歸納了CREB 通過調節突觸可塑性對記憶的調節作用及CREB 激活對認知障礙的改善作用。 在一定范圍內通過調節CREB實現對突觸可塑性的調節,在避免興奮毒性的前提下改善突觸間信息傳遞,CREB 的直接或間接激活劑或許是AD 潛在的治療措施。