帕金森病伴抑郁患者腸道菌群變化及其代謝功能分析

任騰竹, 李桂花, 梁肖玉, 郭琳玲, 劉新通

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是臨床常見的神經變性疾病,其中抑郁為PD最常見的非運動癥狀之一。腸道菌群及其代謝產物與PD和抑郁癥的發生、發展具有關聯性。對散發PD患者的尸檢發現,α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)最早出現在腸道神經系統和迷走神經運動背核,提示PD發病可能起源于胃腸道[1]。迷走神經是腦-腸軸神經解剖的基礎,可將腸道的各種信號傳遞至大腦,影響5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的釋放,實現對腦部高級活動、精神行為、認知功能的調控,提示腸道菌群可能通過神經內分泌等途徑參與抑郁癥的發病過程[2]。目前,國內PD伴抑郁(Parkinson′s disease and depression,DPD)患者腸道菌群特征的研究報道尚鮮見。鑒此,本研究通過高通量測序技術對受試者腸道菌群進行分析,旨在探究DPD患者的特征性腸道菌群及差異代謝通路,以進一步明確DPD的發病機制,為DPD的無創性診斷和治療提供新的證據。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2021年6月至2022年10月廣東省第二人民醫院神經內科收治的原發性PD患者95例,均符合2015年國際運動障礙協會(Movement Disorder Society,MDS)制訂的原發性PD的診斷標準[3]。根據第4版《精神障礙診斷與統計手冊》中關于抑郁障礙的診斷標準[4]分為DPD組(48例)和帕金森不伴抑郁組(NDPD組,47例)。DPD組漢密頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)評分≥7分。選入PD患者的健康配偶43名作為對照組,符合中華醫學會老年醫學學會建議的健康人標準[5]。排除標準:(1)因血管性、藥物、中毒、外傷等原因所致的PD患者;(2)原發性震顫、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、皮質基底節變性等帕金森疊加綜合征患者;(3)有腦卒中、癡呆、其他精神疾病及其他中樞神經系統變性患者。研究對象均來自廣東省及周邊地區,飲食結構相似,均衡飲食(無素食主義者),無種族差異。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準(2021-KZ-049-03),所有研究對象簽署知情同意書。

1.2量表評分 所有受試者完成日常生活活動能力(Activity of Daily Living,ADL)量表評分及簡易智力狀態檢查(Mini-mental State Examination,MMSE),需具有日常生活自理能力且無認知功能障礙(MMSE評分要求:教育年限<6年者,≥19分;教育年限為7～12年者,≥22分;教育年限超過12年者,≥24分)[6]。PD患者完成MDS統一帕金森病評分量表的第3部分(MDS Unified-Parkinson Disease Rating Scale-Ⅲ,MDS-UPDRS-Ⅲ)評分,Hoehn-Yahr分級量表(Hoehn and Yahr scale,H-Y)評分和PD患者生活質量問卷(the 39-Item Parkinson′s Disease Questionnaire,PDQ-39)評分。

1.3糞便標本采集、PCR擴增及高通量測序 采集研究對象新鮮、中后段、內部糞便,避免廁所污水及馬桶上微生物的污染,收集于含有保存液的、專用的無菌微生物DNA采集保存管中。樣本采集量≥2 g,采集完成24 h內放入-80 ℃冰箱凍存備檢。本研究采用細菌16SrDNA V3-V4區特異性引物進行PCR擴增,PCR產物采用凝膠回收試劑盒進行純化。純化的PCR產物通過PCR的方法添加測序需要的接頭和barcode,產物采用凝膠回收試劑盒進行純化。純化的PCR產物采用qPCR進行定量后按照等摩爾比進行混合,完成文庫構建,應用Illumina MiSeq高通量測序平臺進行測序。PCR擴增及高通量測序由微基生物科技(上海)有限公司完成。

1.4生物信息學分析 使用Mothur軟件在97%相似水平下對所有序列進行可操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)歸類。α及β多樣性分析是基于OTUs的計數統計。α多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性,是反映豐富度和均勻度的綜合指標。β多樣性是指沿環境梯度不同生境群落之間物種組成的差異性。α和β多樣性分析使用Mothur、QIIME和R軟件等進行分析。以Bray-Curtis距離矩陣和UniFrac分析來展示不同樣本之間的β多樣性差異。其中weighted考慮物種的豐度,unweighted沒有對物種豐度進行加權處理。組間多樣性差異的顯著性由ANOSIM檢驗來確定,檢驗水準α=0.05。在獲知組間主要差異物種的基礎上,利用Lefse(LDA effect size)軟件進行線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA),對數據降維和評估顯著差異物種的影響力(LDA分值>2)。通過拷貝數對OTUs表進行歸一化,并使用KEGG數據庫進行比對,對菌群代謝功能進行PICRUSt2代謝功能分析。通過Kruskal-Wallis檢驗方法得到對照組、DPD組和NDPD組間KEGG第三層級的、顯著差異的代謝途徑。在此基礎上對三組相對豐度均值求和后,對相對豐度最高的前20個代謝通路進行排序。

2 結果

2.1三組一般臨床資料比較 三組體質量指數(body mass index,BMI)、MMSE評分、HAMD評分比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組一般臨床資料比較

2.2三組腸道菌群多樣性比較 與對照組相比,DPD組和NDPD組的菌群α多樣性顯著升高(P<0.05)。見圖1??；贐ray-Curtis距離矩陣的β多樣性分析結果顯示,DPD組和NDPD組在屬水平上的腸道菌群構成差異有統計學意義(ANOSIM test:R=0.111,P=0.022)。見圖1??；赨niFrac分析的Weighted-UniFrac β多樣性分析結果顯示,DPD組和NDPD組的腸道菌群構成存在顯著差異(ANOSIM test:R=0.084,P=0.036)。見圖1?。結果提示三組間腸道菌群的菌種豐度及構成存在差異。

2.3三組腸道菌群構成比及菌屬差異比較 DPD組放線菌門(Actinobacteria)、互養菌門(Synergistetes)豐度較對照組和NDPD組增加,與對照組比較差異有統計學意義(P=0.006;P=0.018),但與NDPD組比較差異無統計學意義(P=0.466;P=0.987)。見圖1?。進一步的LDA結果顯示,放線菌門、互養菌門為DPD組門水平的差異性菌群。紅蝽菌目(Coriobacteriales)、互養菌目(Synergistales)為DPD組目水平的差異性菌群;理研菌科(Rikenellaceae)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae)、互養菌科(Synergistaceae)為DPD組科水平的差異性菌群。DPD組差異菌屬包括:另枝菌屬(Alistipes)、Anaerotruncus屬、Dielma屬、霍爾德曼氏菌屬(Holdemania)、芽胞桿菌屬(Cloacibacillus)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)。見圖1?,表2。NDPD組差異菌屬包括:瘤胃菌屬(Ruminococcus);Adlercreutzia屬;Christensenella屬、Barnesiella屬、Coprococcus屬、Butyricimonas屬、Anaerofilum屬、Odoribacter屬、Fusicatenibacter屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)。見圖1?。

?三組α多樣性指數比較;?在OTU水平上,三組基于Bray-Curtis距離矩陣的β多樣性分析結果;?在OTU水平上,三組基于Weighted-UniFrac的β多樣性分析結果;?三組在門水平上的菌群相對豐度;?三組特征性腸道菌群LDA值分布的直方圖

表2 DPD組差異性菌屬在三組間的相對豐度比較結果

2.4DPD組差異性菌屬相對豐度與抑郁評分的相關性分析結果 Spearman秩相關性分析結果顯示,另枝菌屬、Anaerotruncus屬、Dielma屬、霍爾德曼氏菌屬、芽胞桿菌屬、柯林斯氏菌屬的相對豐度與HAMD評分呈正相關。見表3。

表3 DPD組差異性菌屬相對豐度與HAMD評分的Spearman秩相關性分析結果

2.5DPD患者差異性腸道菌群的功能分析結果 通過PICRUSt2分析DPD患者差異性腸道菌群的代謝功能,通過Kruskal-Wallis檢驗方法獲得第三層級排名前20的顯著差異通路。結果顯示,DPD組差異性腸道菌群的顯著代謝通路包括:光合生物中的碳固定(DPD組 vs NDPD組,P=0.005;DPD組 vs 對照組,P=0.033;NDPD組 vs 對照組,P=0.534)和抗壞血酸抵抗(DPD組 vs NDPD組,P=0.019;DPD組 vs 對照組,P=0.431;NDPD組 vs 對照組,P=0.098)。NDPD組顯著代謝通路包括:細菌雙組分調節系統、丙酮酸鹽代謝、細菌的聚量效應、泛酸和輔酶A生物合成、纈氨酸生物合成、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、萬古霉素抵抗、細菌趨藥性、胰高血糖素信號通路、凋亡通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化代謝通路和AMPK代謝通路。對照組顯著代謝通路包括:果糖和甘露糖代謝、脂多糖生物合成、葉酸生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸內酯相互轉化、維生素B6代謝通路、生物堿代謝通路。見圖2。

圖2 顯著差異通路結果圖(top 20,*P<0.05)

3 討論

3.1PD患者的DPD發病率高達50%,多發生于PD的早期階段,對患者生活、認知和社會功能造成嚴重影響[7]。研究發現腸道細菌及其代謝產物可啟動天然免疫應答,增強α-syn的炎癥作用,并誘導α-syn的聚集和錯誤折疊,導致多巴胺(dopamine,DA)神經元凋亡[8]。DPD的發生可能與PD本身發病機制相關,DPD患者黑質致密部中DA神經元的丟失約是NDPD患者的7倍[9]。鼠李糖乳桿菌可升高應激小鼠海馬區等情緒相關腦區的GABA受體亞單位的表達水平,進而減輕應激相關的抑郁樣行為,表明腸道菌群對神經遞質的調控可能與抑郁癥相關[10]。單胺神經系統退行性病變導致DPD發病是目前較為公認的觀點,但與原發性抑郁相比,DPD更多表現為焦慮不安、易怒、悲傷、對未來感到悲觀、自殺念頭,而負罪感、自責、失敗感及自殺率較低。腸道菌群參與PD及抑郁癥的發病機制已有研究證實,然而目前針對DPD的病因學研究尚無明確定論,且臨床實踐發現經藥物治療后仍有部分患者的抑郁癥狀未得到有效緩解,并存在不同程度的副作用。

3.2隨著生物信息學技術在神經科學領域的發展,通過高通量測序技術探究DPD患者特征性腸道菌群,為尋找DPD腸道生物標志物、闡明發病機制及早期診斷和精準治療提供了理論依據。本研究探討了DPD患者特征性腸道菌群,α多樣性分析結果發現PD患者腸道菌群的物種多樣性較健康者增加,這與既往研究一致[11]。此外,本研究證實了DPD和NDPD組之間,尤其是在屬水平上,β多樣性指數存在顯著差異。結果表明DPD患者的腸道菌群成分結構與NDPD患者和健康人群存在差異。

3.3本研究結果顯示,在門水平上,與對照組相比,DPD組放線菌門豐度顯著增加,而擬桿菌門豐度顯著減少,這與此前有關PD[12]及抑郁癥[13-14]患者特征性腸道菌群的研究結論相同。本研究結果顯示,DPD患者紅蝽菌科的柯林斯氏菌屬豐度均顯著增多。紅蝽菌科容易定植于黏膜表面[15],在應激反應小鼠模型盲腸中顯著增加,與活性氧的產生呈正相關,其致病性可能與腸道屏障和代謝功能障礙有關。丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)的霍爾德曼氏菌屬在抑郁癥伴高血壓患者腸道菌群中豐度增加,并與患者的焦慮、壓力水平呈正相關[16]。丹毒絲菌科產丁酸菌屬與許多代謝疾病相關[17-18],這可能與其釋放的脂多糖介導的炎癥反應有關,提示該菌可能在維持免疫平衡中發揮一定作用。本研究發現DPD組丹毒絲菌科中霍爾德曼氏菌屬、Dielma屬增加,與上述研究結論一致。但也有報道稱PD患者中丹毒絲菌科相對豐度減少[19]。提示Dielma屬和霍爾德曼氏菌屬可能為DPD患者的特征性腸道菌群標志物。此外,本研究分析得出互養菌門、芽胞桿菌屬在DPD患者腸道菌群顯著增加。癲癇焦慮伴抑郁患者腸道菌群芽胞桿菌屬豐度增高,且隨著癲癇發作嚴重程度加重不斷升高[20]?；ヰB菌目在系統性紅斑狼瘡患者腸道中豐度增加,提示該菌與免疫炎癥相關[21]。

3.4本研究結果表明,另枝菌屬在DPD患者中顯著升高,與先前PD[11]及抑郁癥[13]相關研究一致。血清素是色氨酸轉化后的產物,另枝菌屬的增加會降低血清素的利用率,而血清素減少與抑郁癥發生相關[22]。然而,另枝菌屬豐度增加也可能有抗抑郁作用。腸道菌群的代謝產物短鏈脂肪酸(short chain fat acids,SCFAs)可以保持腸道上皮的完整性,調節免疫應答反應和免疫調節功能,降低DNA氧化損傷,降低人體炎癥水平和增強胃腸道運動機能[23]。另枝菌屬是SCFAs的主要生產者,另枝菌屬豐度降低會導致SCFAs減少,加劇神經免疫炎癥反應[24]。另枝菌屬可表達谷氨酸脫羧酶,可將谷氨酸代謝為GABA。另枝菌屬豐度增加則GABA神經元活性增強,從而提升GABA神經遞質水平達到抗抑郁效果[25]。

3.5PICRUSt2能夠幫助研究者理解微生物功能的改變。本研究發現,DPD組特征性腸道菌群與光合生物中的碳固定和抗壞血酸抵抗這兩條代謝通路相關。一項蛋白組學研究結果指出,蛋白?；@著富集在以碳代謝為特征的代謝通路中[26]。蛋白質乙?；驯蛔C實廣泛參與枯草芽胞桿菌屬的多種生化過程,包括趨化作用、營養代謝、應激反應和毒素合成,從而調節細胞代謝[27]?？箟难嶙鳛橐环N還原性維生素在中樞神經系統中參與抗氧化、酶輔助及神經調制等過程,臨床試驗和動物實驗研究均表明抗壞血酸具有抗抑郁作用[28]?？箟难岽x途徑顯著富集于精神分裂癥患者的腸道菌群,且精神分裂癥患者腸道菌群中柯林斯氏菌屬相對豐度顯著高于健康對照組[29]。以上結果提示,DPD患者芽胞桿菌及柯林斯氏菌屬可能通過蛋白質乙?；?、抗壞血酸抵抗代謝途徑參與多種生物合成、代謝過程,而其與DPD的發生、發展是否具有相關性仍有待進一步研究。

3.6近期有研究證實菌群α多樣性與體脂率呈負相關,即體脂率越高,菌群α多樣性越低;瘤胃球菌與體脂率的相關性最強[30]。本研究中DPD組BMI較另外兩組顯著增高,而DPD組α多樣性顯著增高,但瘤胃球菌并非DPD組差異性菌屬。本研究團隊的前期研究發現紫單胞菌科為PD伴認知功能障礙特征性菌屬[31],而對照組紫單胞菌科豐度較其他兩組并無顯著增高。因此認為,BMI及認知功能評分雖存在組間差異,但對本文特征性菌群結果的影響不大。

3.7本研究納入了PD組的健康配偶作為對照組,他們擁有相似的生活環境和飲食習慣,具有較好的匹配性。但是,本研究也存在一定的局限性:(1)研究樣本均來自廣東省,限制了研究結果的廣泛適用性;(2)糞便采樣及分析僅限于單病程階段。在下一步的研究中,研究團隊將招募更多患者,進行亞組分析(地區、飲食結構、病程等),并對本文得出的差異菌群展開驗證實驗,探究顯著差異代謝通路在DPD患者腸道中的相關菌群及其作用機制,為DPD的診斷和治療提供新的線索和理論依據。

綜上所述,腸道菌群結構、特征性差異菌屬及其代謝通路的變化可能與DPD的發生、發展有關,值得進一步探索。