HLA-B*15∶02基因型的快速鑒別方法建立及臨床應用*

初亞男,封利穎,李玉嬌,張婕妤

中國人民解放軍東部戰區總醫院臨床藥學科,江蘇南京 210002

卡馬西平是常用的抗癲癇藥物,史蒂文斯-約翰遜綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)是這種藥物可能引起的致死性皮膚不良反應。VigiBase數據庫中單一藥物引起 SJS 排名前三的藥物中就包括苯妥英鈉和卡馬西平[1]。此外,奧卡西平作為卡馬西平的酮基衍生物也會發生類似的嚴重不良反應?？R西平、苯妥英鈉、奧卡西平同屬于芳香族類抗癲癇藥物。近年發現攜帶人類白細胞抗原(HLA)-B*15∶02基因的亞洲人群服用上述藥物發生SJS/TEN的風險顯著高于不攜帶人群,因此,HLA-B*15∶02基因攜帶者應考慮避免使用上述3種藥物作為替代藥物[2]。常規的HLA分型方法有低分辨的聚合酶鏈反應-等位基因特異性引物法(PCR-SSP)[3]、聚合酶鏈反應-序列特異寡核苷酸探針法(PCR-SSOP)[4]及高分辨的聚合酶反應-直接測序法(PCR-SBT)[5]等,上述方法操作煩瑣、需要專用軟件、檢測成本高、耗時長[6],陸續有研究人員發現可以用單核苷酸多態性位點(SNP)表征特定的HLA基因型。本研究擬采用操作簡便、靈敏度高、無須熒光標記的焦磷酸測序法建立rs144012689位點多態性分析方法,分析其與Sanger測序、商品化試劑盒的一致性,并采用已確診為SJS的病例進行驗證,初步評估本研究建立的測序方法的臨床適用性。

1 資料與方法

1.1一般資料 驗證標本來源于本科室標本庫中已完成HLA-B分型的40例患者的核酸標本(40份)及隨機核酸標本(20份),采用中國臺灣世基生物公司HLA-B位點 1502 基因檢測試劑盒(簡稱世基試劑盒)完成檢測的核酸標本40份。2019-2021年在本院確診為芳香族類抗癲癇藥物誘發的SJS不良反應患者2例。

1.2儀器與試劑 焦磷酸測序試劑盒及緩沖液購自德國QIAGEN公司,HLA-B位點 1502 基因檢測試劑盒購自中國臺灣世基生物公司,Taq酶購自日本TaKaRa公司,全血基因組提取試劑盒購自美國Promega公司,實驗用水為滅菌蒸餾水,其他試劑均為分析純。Q24焦磷酸測序儀購自德國QIAGEN公司,SLAN96S實時熒光定量PCR儀購自上海宏石公司,A200基因擴增儀購自杭州朗基科學儀器公司,微量紫外分光光度計購自南京伍義公司。

1.3方法

1.3.1全血基因組DNA提取 本研究采用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取全血中基因組DNA,對提取的基因組DNA進行純度和濃度測定,確保A260/A280在1.8～2.0,按照說明書將世基試劑盒檢測的基因組DNA標本的質量濃度控制在12.5～50.0 ng/μL。

1.3.2焦磷酸測序引物的設計和合成 采用Assay Design Software 2.0進行引物設計,使用Primer 5.0進行篩選,所有引物由Invitrogen公司合成,引物序列見表1。

表1 rs144012689位點的焦磷酸測序引物

1.3.3PCR體系優化和焦磷酸測序 PCR反應體系和焦磷酸測序方法參考作者已發表的文章所述[7]。測序推注堿基的順序為“GTAGCA”,其中第2個堿基“T”為rs144012689位點的野生信號峰,第3個堿基“A”為rs144012689位點的突變信號峰,根據測序圖譜“A”信號峰的有無判別是否攜帶HLA-B*15∶02基因。將引物組進行配對后,根據單堿基峰高和比例篩選最佳引物。分別考察55 ℃、60 ℃、65 ℃退火溫度下的擴增效率,根據單堿基峰高評價最適的退火溫度。梯度稀釋人基因組DNA至10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、0.4 ng/μL及空白對照4個梯度平行擴增并測序3次,根據單堿基峰高和比例評價本方法的檢測限。

1.3.4靈敏度和特異度考察 HLA-B基因PCR-SBT高分辨分型是鑒別該基因分型的金標準。為了評價本研究建立的rs144012689位點焦磷酸測序法表征HLA-B*15∶02基因型的性能。對40份已完成HLA-B基因PCR-SBT高分辨分型的標本采用焦磷酸測序檢測進行rs144012689位點檢測,評估rs144012689位點的靈敏度(采用焦磷酸測序檢測rs144012689正確判定檢測標本含有HLA-B*15∶02基因型的比例)和特異度(采用焦磷酸測序檢測rs144012689正確判定檢測標本不含有 HLA-B*15∶02基因型的比例)。

1.3.5焦磷酸測序與Sanger測序和商品化試劑盒的一致性評價 本研究使用的焦磷酸測序技術屬于邊合成邊測序的酶聯級聯測序技術,Sanger測序基于雙脫氧鏈終止法進行測序屬于一代測序,是驗證測序結果準確性的金標準。因此本研究從標本庫中選擇20份標本,同時采用焦磷酸測序和Sanger測序對rs144012689位點進行檢測,比較兩種測序方法的一致性。選擇標本庫中的40份標本,按照世基試劑盒說明書要求進行HLA-B*15∶02基因檢測,同時將40份標本進行焦磷酸測序,比較本研究建立方法與商品化試劑盒檢測的一致性,將篩查出的陽性標本外送進行HLA-B基因的高分辨分型,檢測結果使用Kappa分析進行一致性評價。

1.3.6建立的方法對SJS綜合征患者的臨床應用 收集本院2019-2021年確診為芳香族類抗癲癇藥物所致SJS的患者,同步進行PCR-SBT分型和rs144012689位點焦磷酸測序檢測。評價本方法對確診病例的檢出性能。

2 結 果

2.1PCR體系優化結果 根據單堿基峰高和測序峰比例篩選出上游引物1、下游引物1、測序引物2為最優引物組,55 ℃、60 ℃、65 ℃退火溫度下,單堿基峰高分別為240 mV、275 mV和170 mV,因此60 ℃為最佳退火溫度。本方法的檢測限為0.4 ng/μL,見圖1。

注:圖中灰色區域為 SNP 的判別區域。

2.2靈敏度和特異度結果 40份標本中,HLA-B高分辨分型含有HLA-B*15∶02型的標本有2份,分別為HLA-B*15∶02及HLA-B*44∶03型標本1份和HLA-B*15∶02及HLA-B*51∶01型標本1份,不含有HLA-B*15∶02型的標本有38份,包括與HLA-B*15∶02型相近的HLA-B*15∶01型、HLA-B*15∶11型、HLA-B*15∶18等型別。焦磷酸測序結果為TA型的標本有2份,TT型標本有38份,見表2。表明使用rs144012689位點表征HLA-B*15∶02基因型的靈敏度和特異度均為100%。

表2 40標本焦磷酸測序和HLA-B高分辨分型結果(n)

2.3一致性評價結果 20份標本rs144012689位點Sanger測序和焦磷酸測序檢測得到TT型16份,TA型4份,2種方法一致性比較的Kappa值為1,見表3;40份標本焦磷酸測序結果顯示有4份為TA型,與商品化試劑盒檢測出的4份陽性標本一致;2種方法一致性比較的Kappa值為1,見表4。2019-2021年共計對89例考慮服用芳香族類抗癲癇藥物和已經發生藥物性皮炎(藥疹)的患者進行rs144012689位點的檢測,共計篩查出12份“A”型基因攜帶者,其中2例為SJS確診患者,1例為服用卡馬西平后誘發的藥疹,1例有奧卡西平過敏史,在服用丙戊酸鈉和托吡酯時發生了交叉過敏反應[8],2例患者rs144012689位點檢測結果為TA型。將上述10份TA型標本外送進行HLA-B基因的高分辨分型,結果顯示10份標本均含有HLA-B*15∶02基因型。上述驗證結果說明本研究建立的方法與另外兩種方法的一致性良好,具有良好的臨床應用潛力。

表3 20標本焦磷酸測序和Sanger測序結果(n)

表4 40標本焦磷酸測序和世基試劑盒結果(n)

3 討 論

我國已經在一些地區施行了按疾病診斷相關分組(DRGs)完成支付的試點改革,對細化臨床用藥方案,提升合理用藥水平和提高醫療質量做出了更高的要求。藥物的不良反應是造成患者住院時間延長、住院和藥品費用增加的重要因素[9]。用藥前進行HLA-B*15∶02基因型篩查將為避免不良反應發生,降低患者治療成本,實現個體化給藥提供技術支撐。本研究結果表明,rs144012689位點“A”等位基因與HLA-B*15∶02基因型存在100%的連鎖關系,與前期中國香港漢族人群和美國亞洲人群中的研究結果(96.7%～100.0%)相近[10-11]。因此,可以使用rs144012689位點的分型檢測代替傳統的HLA分型方案。rs144012689位點附近的rs2596496多態性會影響rs144012689位點的分型結果,尤其干擾以雜交原理為基礎的TaqMan探針法、芯片法等技術的靈敏度和特異度,直接測序可以克服這一缺點,常見的一代測序方法中焦磷酸測序法因其操作簡單、檢測時間短、通量高的優點更適用于SNP分型。本研究基于焦磷酸測序建立的rs144012689位點檢測方法,檢測限低至0.4 ng/μL基因組DNA,高于商品化試劑盒的12.5～50.0 ng/μL基因組DNA,檢測時間從獲得標本采集到測序完成僅需要3 h,遠低于HLA高分辨分型3～5 d的檢測時間,與HLA高分辨分型和HLA-B位點基因檢測試劑盒陽性和陰性的篩查結果一致。該方法較高分辨分型方法[12]的檢測成本低,是實現成本效益優勢的一個可行手段。但是本研究也存在一些不足,需要進一步增加樣本量和陽性病例數對本方法的檢測性能進行進一步評價。