結直腸癌組織中TMCO1、CALR 的表達水平與其根治術后預后轉歸的相關性分析

孫春龍，宋詠霞，王億鵬

手術切除腫瘤是目前治療結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的主要方式，但研究表明，行切除術與輔療法治療的患者， 僅有20%的患者能夠痊愈，每年新診斷的CRC 患者中， 有20% ～25%的患者出現轉移或轉移性疾?。?-3］。因此，尋找可能監測評估CRC 根治術術后的預后轉歸因子仍是臨床關注的熱點?？缒ぞ砬菪Y構域蛋白1（TMCO1）是位于內質網上的新型鈣離子通道蛋白， 鈣網蛋白（Calreticulin，CALR）是內質網上高度進化的鈣結合蛋白， 近年來有許多研究發現，TMCO1 和CALR 與腫瘤的增殖、轉移有關［4-5］。故本研究擬通過對行根治術CRC 患者的TMCO1、CALR 的表達水平進行檢測，分析其對患者術后預后轉歸的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017 年1 月～2018 年12 月于威海市文登區人民醫院行根治術的182 例CRC 患者。其中男性101 例，女性81 例；年齡28 ～76 歲，平均（43.67 ± 13.89）歲；體質量指數（BMI）17.9 ～27.3 kg/m2；腫瘤大小3.1 ～8.5 cm；復發轉移23 例，無復發轉移159 例；病變位置結腸81 例，直腸101 例；糖尿病96 例，無糖尿病86 例；低分化37 例，中分化45 例，高分化100 例；TNM 臨床Ⅰ期47 例，Ⅱ期74 例，Ⅲ期61 例；浸潤深度T155 例，T273 例，T354例。納入標準：（1）診斷標準符合《結直腸癌診療規范（2010 年版）》， 且經病理學檢查確診為CRC［6］；（2） 所有患者均接受根治性手術；（3） 過往未有放療、化療史。排除標準：（1）伴有其他急性、慢性肝腎功能障礙疾病或惡性腫瘤患者；（2） 心功能不全或患有先天性心臟病患者；（3）隨訪信息不全患者。

1.2 方法 收集所有患者基線資料包括年齡（歲）、性別、BMI（kg/m2）等一般資料以及腫瘤位置、直徑（cm）、合并糖尿病、住院時間（d）、術中出血量（ml）、臨床分期、浸潤深度、分化程度和手術時長（h）等病理信息。

收集CRC 患者根治手術后切除的癌組織和癌旁正常組織標本，置于10%中性甲醛中固定，并用石蠟包埋，后將其切為厚度3 μm 的片，常規脫蠟、烘干水分，用pH 為8.0 的乙二胺四乙酸（EDTA）進行抗原修復，20 min 后滴加鼠抗人TMCO1、CALR單克隆抗體（試劑盒購自英國Abcam 公司）， 比例1：250，4℃條件下孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次， 滴加二抗工作液在室溫下孵育60 min，再以PBS 洗滌3 次，用二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染3 min，脫水，中性樹膠封片。

采用BM1000 顯微鏡（南京江南永新光學有限公司，批準文號：蘇械注準20172221144）在400 倍鏡下對染色標本進行觀察， 隨機選擇切片上10 個不同視野，評價每個視野下細胞的著色強度和陽性細胞占視野內細胞的百分比，計算總評分，取平均值。著色強度共0 ～3 級，分別代表無顏色、黃色、棕黃色和棕褐色。陽性細胞占視野內細胞百分比：X ＜1%， 計0 分；1%≤X ＜33%， 計1 分；33%≤X ＜66%，計2 分；66%≤X ＜100%，計3 分?？傇u分=陽性細胞視野占比×細胞著色強度，總評分≥2 定義為陽性，否則為陰性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0 統計軟件處理數據，計數資料采用（%）表示，行χ2檢驗；計量資料數據符合正態性，用（±s）表示，行t 檢驗；采用Logistic 回歸分析CRC 患者根治術后復發轉移的獨立危險因素， 以Kaplan-Meier 生存曲線分析患者3年內的生存率，P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMCO1 和CALR 在癌組織和癌旁正常組織中的表達 CRC 患者癌旁正常組織TMCO1 和CALR的陽性表達率分別為13.74%、15.38%， 與癌組織（41.21%、43.41%）相比，差異具有統計學意義（P ＜0.05）；見表1。

表1 182 例CRC 患者癌組織及癌旁正常組織TMCO1 和CALR 表達水平比較［例（%）］

2.2 根治術后CRC 患者復發轉移的因素分析

2.2.1 單因素分析 行根治術后3 年內，患者復發率為6.59%（12/182）， 轉移率為6.04%（11/182），總體 發 生 率 為12.64%（23/182）；TMCO1、CALR 在 復發、轉移患者中陽性表達率顯著高于無復發、轉移患者的陽性表達率，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

單因素分析結果顯示，復發組、轉移組中發生復發/轉移患者的性別、 腫瘤位置、 合并糖尿病、BMI、住院時間、術中出血量、臨床分期和手術時長與無復發/轉移組患者比較， 差異無統計學意義（P＞0.05）；復發組患者的年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、TMCO1 和CALR 與無復發組比較， 差異有統計學意義（P ＜0.05）；轉移組患者腫瘤分化程度、腫瘤直徑、浸潤深度、TMCO1 和CALR 與無轉移組比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 182 例食管癌根治術后患者復發轉移的單因素分析［例（%），±s］

表2 182 例食管癌根治術后患者復發轉移的單因素分析［例（%），±s］

注：BMI.體質量指數；TMCO1.跨膜卷曲螺旋結構域蛋白1；CALR.鈣網蛋白

因素性別復發情況復發（n=12）無復發（n=170）t/χ2 值P 值 轉移情況 t/χ2 值 P 值轉移（n=11） 無轉移（n=171）男女7（58.33）5（41.67）94（55.29）76（44.71）0.042 0.838 4（36.36） 97（56.73） 1.008 0.315 7（63.64） 74（43.27）腫瘤位置直腸結腸分化程度低分化中分化高分化TNM 臨床分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期浸潤深度T1 T2 T3合并糖尿病6（50.00）6（50.00）75（44.12）95（55.88）0.157 0.692 7（63.64） 74（43.27） 1.008 0.315 4（36.36） 97（56.73）7（58.33）3（25.00）2（16.67）30（17.65）42（24.71）98（57.65）11.746 0.001 8（72.73） 29（16.96） 14.624 ＜0.001 1（9.09） 44（25.73）2（18.18） 98（57.31）2（16.67）4（33.33）6（50.00）45（26.47）70（41.17）55（32.36）1.628 0.443 3（27.27） 44（25.73） 3.009 0.222 2（9.09） 72（29.24）6（45.45） 55（25.73）2（16.67）2（16.67）8（66.67）53（31.18）71（41.76）46（27.06）5.451 0.020 1（9.09） 54（31.58） 4.115 0.043 4（36.36） 69（40.35）6（54.55） 48（28.07）有無5（41.67）7（58.33）91（53.53）79（46.47）0.633 0.426 3（27.27） 93（54.39） 3.048 0.081 8（72.73） 78（45.64）TMCO1陽性陰性CALR陽性陰性年齡（歲）BMI（kg/m2）腫瘤直徑（cm）住院時間（d）術中出血量（ml）手術時長（h）11（91.67）1（8.33）64（37.65）106（62.35）11.363 0.001 10（90.91） 65（38.01） 9.853 0.002 1（9.09） 106（61.99）10（83.33）2（16.67）58.16 ± 10.16 19.12 ± 2.30 4.71 ± 1.46 18.19 ± 5.97 121.50 ± 26.49 2.84 ± 1.47 69（40.59）101（59.41）64.49 ± 9.25 20.14 ± 3.15 5.24 ± 1.03 20.36 ± 4.82 118.37 ± 30.31 3.11 ± 1.23 8.337 2.277 1.100 1.672 1.483 0.348 0.726 0.004 10（90.91） 69（40.35） 8.795 0.003 1（9.09） 102（59.65）0.024 58.88 ± 9.37 64.30 ± 9.31 1.871 0.063 0.273 19.36 ± 1.80 20.10 ± 3.14 0.772 0.441 0.096 4.25 ± 0.83 5.24 ± 1.05 3.063 0.003 0.140 18.13 ± 5.84 20.31 ± 4.83 1.433 0.154 0.728 123.50 ± 28.61 118.35 ± 29.96 0.554 0.580 0.469 2.43 ± 1.18 3.13 ± 1.23 1.834 0.068

2.2.2 多因素分析 以CRC 患者術后有無復發、轉移發生為因變量（復發/轉移=1，無復發/轉移=0），以單因素分析中具有統計學意義的因素為自變量進行logistic 多因素分析，結果顯示，年齡、腫瘤低分化、TMCO1 和CALR 是CRC 患者根治術后復發的獨立危險因素（P ＜0.05，OR ＞1）；腫瘤直徑≥5cm、浸潤深度T3、TMCO1 和CALR 是CRC 患者根治術后轉移的獨立危險因素（P ＜0.05，OR ＞1，表3、4）。

表3 182 例食管癌根治術后患者復發的logistic 多因素分析

2.3 Kaplan-Meier 生存曲線 行CRC 根治術3 年內，患者的死亡率為6.04%（11/182），以患者3 年內的生存結局為因變量， 繪制Kaplan-Meier 生存曲線，結果顯示，TMCO1 陽性表達、陰性表達組的累積生存率分別為88.90%、97.30%（χ2=5.346，P=0.021），CALR 陽性表達、 陰性表達組的累積生存率分別為89.60%、97.10%（χ2=4.505，P=0.034），總體平均生存率為94.00%。

表4 182 例食管癌根治術后患者轉移的logistic 多因素分析

3 討論

CRC 的發病機制復雜，因病變部位在人體微生物最豐富的消化道中，一些特定細菌如具核梭桿菌容易在結直腸處富集，甚至存在于肝轉移病灶中，產生基因毒性物質， 誘發基因突變致使CRC 發生［7］。該疾病特點使得根治術后患者易出現病情復發或轉移，不利于患者預后，本研究182 例CRC 患者中，根治術后3 年內患者的復發轉移發生率為12.64%，表明CRC 根治術患者的預后仍有待改善。

本研究結果顯示，CRC 患者癌旁正常組織TMCO1 和CALR 的陽性表達率顯著低于癌組織，表明TMCO1 和CALR 在CRC 患者中有異常表達現象，Logistic 因素分析顯示，TMCO1 和CALR 均為根治術后患者復發、轉移的獨立危險因素，提示了該兩種因子的陽性表達與術后的預后轉歸有密切關聯，且其陽性表達率越高，患者復發轉移的風險更高。TMCO1 形成的蛋白質通道對鈣離子（Ca2+）具有高選擇性， 對內質網中的Ca2+濃度的調控起到重要作用，當內質網中的Ca2+過載負荷時，鈣信號紊亂，此時機體能激活TMCO1，促進鈣的釋放［5，8］。CALR是細胞內質網內具有高度保守性的一種多功能蛋白質，常在鈣通道中表達并結合，主要參與蛋白質的折疊，維持體內Ca2+動態平衡［9］。因此，TMCO1 和CALR 兩者對腫瘤細胞中的Ca2+調節均具有重要意義，而Ca2+在細胞中能影響細胞的信號傳導，參與細胞的增殖、分化和凋亡，廣泛存在于癌細胞的生長和轉移中，當Ca2+濃度周期規律性上升時，Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ通道被激活，該通路能介導癌細胞的增殖和遷移，催化CRC 的發生發展［10］。孫凱［11］的研究認為，TMCO1 高表達于肺腺癌及其轉移癌細胞侵襲前端， 可通過Ca2+上調骨形態發生蛋白的表達，從而破壞細胞外基質，導致癌細胞遷移；齊順利等［12］報道指出，TMCO1 可能通過刺激內質網的氧化應激作用促進結腸癌的發生， 且TMCO1 能降低CALR 的表達， 抑制結腸癌的侵襲和遷移過程。以上研究理論和報道均支持了本研究的結果。

此外，研究在患者行根治術后3 年內對患者進行隨訪生存情況， 結果顯示，TMCO1、CALR 陽性表達組與陰性表達組的生存率具有明顯差異， 表明TMCO1、CALR 的陽性表達能影響CRC 根治術患者的生存結局和生存質量。提示在臨床工作中，可以根據CRC 患者癌組織TMCO1 和CALR 的陽性表達率，判斷根治術術后的預后轉歸，但本研究的樣本量有限且為單中心樣本，TMCO1、CALR 兩種因子作為預測指標在臨床實際應用的準確率仍需要大量實踐加以證實，有待進一步的修正。

綜上所述，CRC 組織的TMCO1 和CALR 的陽性表達與其根治術后的預后轉歸有一定的關聯，可作為判斷患者預后的預測因子。