瑞替加濱抗驚厥及對驚厥性海馬損傷保護效果的研究

徐靜怡,張心雨,李連俊,劉陽,余建東,馮占輝,葛榮靖

驚厥(seizure)是由短暫腦功能障礙引發的一系列以軀體抽動為特征的疾病過程。嚴重或者持續時間較長的驚厥可致受累腦區發生驚厥后損傷,引起繼發性腦功能障礙[1]。這種驚厥繼發性腦損傷也可能是促進癲癇發生發展的原因。因此,及時中止發作等級較高或持續時間較長的驚厥具有非常重要的意義。

瑞替加濱(retigabine, RTG)是一種K+通道開放劑,特異性作用于電壓門控K+通道 KCNQ2-5(Kv7.2-7.5)[2-3]。RTG可增加KCNQ2-5通道的開放頻率及開放持續時間,通過增加K+外流對神經元發揮持續超極化影響,使過度興奮的細胞恢復靜息狀態[4-5]。RTG也可減慢大腦中抑制性遞質GABA的代謝[6],增強神經元中抑制性突觸電流,發揮抑制神經元興奮的作用[7-8]。在藥代學方面,RTG易于吸收,Tmax為1～2 h。在單次和多次給藥后,其血藥濃度隨劑量線性增加。本研究擬通過毛果蕓香堿誘導的急性驚厥小鼠模型,采用RTG進行干預,分析其抗驚厥效果以及是否對海馬神經元的驚厥性損傷具有保護作用,為探索該藥的抗驚厥療效提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗設備及試劑

RTG(上海麥克林公司)、東莨菪堿(美國Sigma)、毛果蕓香堿鹽酸鹽(美國MCE公司)、苯巴比妥鈉(力捷進)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天)、Axon 700B放大器(美國Molecular Devices公司)、Axon 1550B數模轉換器(美國Molecular Devices公司)、玻璃微電極(美國Sutter公司)、電極拉制儀(美國Sutter公司)及正置相差顯微鏡(日本尼康FN1)等。

1.2 實驗動物及分組

成年雄性ICR小鼠40只,8周,體質量30～40 g,購于杭州子源實驗動物科技有限公司,合格證號為SCXK(浙)2019-0004。本研究所有動物實驗均符合《用于科學目的的動物保護歐共體條例(2010/63/EU)》,并獲得蚌埠醫學院動物研究倫理委員會的批準。實驗動物飼養于專用的動物房,飼養環境恒定溫度為23 ℃、保持光照/黑暗12 h恒定循環,自由飲水和攝食。40只ICR小鼠隨機分為空白組(control group)、驚厥組(seizure group)、RTG組(RTG group)及苯巴比妥鈉組(phenobarbital group),每組 10 只,適應性飼養1周后開始用于實驗。

1.3 小鼠急性驚厥模型制作

腹腔注射東莨菪堿(2 mg/kg),30 min后再給予毛果蕓香堿腹腔注射(285 mg/kg)誘發急性驚厥。若ICR小鼠1 h內出現Racine 4～5級驚厥發作(表1),在給予毛果蕓香堿90 min后腹腔注射RTG(2 mg/kg,RTG組)[9-10],或腹腔注射苯巴比妥鈉(94 mg/kg,苯巴比妥鈉組)[11],繼續觀察1 h。詳細給藥方案見圖1。對小鼠造模過程中各級發作的持續時間及發作次數進行統計。小鼠的驚厥發作等級按照Racine分級標準進行分級(表1)[12-13]。

表1 Racine的分級標準及特征

1.4 蘇木素-伊紅染色方法

急性癲癇模型建立1周后,用20%的烏拉坦麻醉小鼠,心臟灌流處死、取腦,將腦固定于4%的多聚甲醛24 h,組織在蔗糖中完成脫水后進行冰凍切片。貼片充分干燥后進行蘇木素-伊紅染色,顯微鏡明場拍攝海馬區圖片。

1.5 膜片鉗記錄方法

用異氟烷將小鼠誘導麻醉后,迅速斷頭取腦,與冰水混合并置于持續通入二元氣(95% O2,5% CO2)的氧飽和人工腦脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF),對鼠腦行冠狀切片(切片厚度為300 μm)。腦片置于持續通二元氣的ACSF中,于35 ℃孵育30 min,再于室溫孵育30 min。將孵育好的腦片轉移至相差顯微鏡下觀察并進行電生理記錄(氧飽和ACSF持續灌流)。鏡下選擇海馬齒狀回顆粒細胞進行全細胞記錄。ACSF成分(mM)為124 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、24 NaHCO3、5 HEPES、12.5 Glucose、2 MgSO4及2 CaCl2。電極內液成分(mM)為150 KGlu、0.5 EGTA、10 HEPES、4 NaCl、4 Mg2ATP、1 TrisGTP及5 phosphocreatine。電極電阻控制在5～8 MΩ,全細胞記錄的串聯阻抗控制在15～30 MΩ。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 RTG可減少小鼠驚厥發作的等級及頻次

在毛果蕓香堿的作用下,小鼠出現不同級別的驚厥發作。本研究選擇注射毛果蕓香堿后1 h內有4～5級大發作的小鼠作為研究對象。采用苯巴比妥鈉作為陽性對照藥物。驚厥組只注射東莨菪堿和毛果蕓香堿,RTG組與苯巴比妥鈉組在此注射基礎上,觀察到大發作后,于毛果蕓香堿注射后90 min進行干預藥物注射(圖1)。觀察90～150 min時間段內各組小鼠的驚厥發作等級,比較藥物的干預效果。

驚厥組小鼠在經歷90 min的前期發作后,在90～150 min觀察時間窗內仍具有較高頻率的驚厥發作,主要以1～3級發作為主,也可出現4～5級大發作。驚厥組小鼠在造模期內死亡率為40%。與驚厥組比較,RTG組小鼠注射RTG后無4～5級大發作出現,但仍可出現數次3級發作,且驚厥發作等級及持續時間降低。注射陽性對照藥物苯巴比妥鈉后,苯巴比妥鈉組小鼠不再出現驚厥發作癥狀。RTG組與苯巴比妥鈉組小鼠的死亡率均在10%以下。

注:實驗分為4組,小鼠驚厥發作等級用不同顏色表示,并以時間軸進行呈現。紅色箭頭為RTG和苯巴比妥鈉的注射時間。開始節點與結束節點之間為組間驚厥發作對比的時間窗口。藥物干預后,與驚厥組比較,RTG組小鼠的發作等級降低且頻次逐漸減少。

2.2 RTG可減輕癲癇小鼠海馬神經元的損傷

在急性驚厥造模結束后,繼續飼養小鼠1周,以觀察驚厥后的遲發性腦損傷情況。選取海馬作為觀察腦區,發現模型小鼠在海馬CA1區出現較為顯著的驚厥后神經元損傷。

蘇木素-伊紅染色結果顯示,空白組小鼠CA1區細胞帶排列整齊、緊密,細胞核清晰、胞質飽滿;驚厥組小鼠海馬區則出現明顯的結構破壞,神經元細胞周圍間隙增大、排列紊亂。細胞丟失導致細胞帶變窄,細胞密度降低(圖2A)。與驚厥組比較,RTG組小鼠CA1區細胞損傷程度較輕。與空白組比較,RTG組小鼠的細胞密度降低(P<0.01),細胞帶寬度變窄(P<0.05)。苯巴比妥鈉組小鼠CA1區細胞帶形態與RTG組相似,兩組在細胞帶寬度及細胞密度兩個方面比較差異均無統計學意義(圖2B、C)。提示RTG具有與苯巴比妥鈉相似的驚厥損傷保護效果。

注:A為蘇木素-伊紅染色圖(海馬CA1區);B為海馬CA1區細胞帶寬度;C為海馬CA1區細胞帶內細胞密度。B、C圖中每個點表示一只小鼠。組間方差齊,采用單因素方差分析。*為P<0.05,**為P<0.01。

2.3 RTG可降低驚厥小鼠海馬齒狀回顆粒細胞的興奮性

齒狀回是海馬外信息流入海馬的重要門控。驚厥后,海馬齒狀回顆粒細胞的興奮性增高,是促進海馬環路過度興奮的重要因素。本研究采用膜片鉗記錄空白組與驚厥組小鼠海馬齒狀回顆粒細胞的興奮性。在驚厥組小鼠完成正常記錄后隨即灌流RTG,觀察其對小鼠顆粒細胞放電的影響?？瞻仔∈箢w粒細胞的放電頻率較低,而驚厥組小鼠顆粒細胞的興奮性顯著增高(圖3)。RTG可顯著減少驚厥小鼠顆粒細胞的放電,降低其興奮性,提示驚厥中應用RTG可通過降低顆粒細胞的興奮性,來減少興奮性信息向海馬中的傳入。

3 討論

本研究應用毛果蕓香堿誘導急性驚厥小鼠模型,采用RTG進行抗驚厥處理并與當前一線抗驚厥藥物苯巴比妥鈉的干預效果進行比較,分析RTG的抗驚厥效果及對海馬神經元損傷的保護作用。本研究結果表明,RTG有一定的抗驚厥作用,可減少驚厥的發作等級及頻次,并對驚厥性海馬損傷具有顯著的保護作用。

RTG是KCNQ2/3通道的特異性開放劑,可以增加由該類通道介導的外向K+電流[14-15]。這種K+電流受到M型膽堿能受體的調控,又被稱為M電流[16-17]。由于該通道慢激活慢失活的動力學特點,M電流變化速度較慢,往往影響序列動作電位后半段動作電位的發放,使得神經元的發放呈現為發放頻率逐漸降低的適應性發放模式[18-20]。此外,RTG可增加GABAA受體介導的抑制性突觸后電流(Inhibitory postsynatic current, ISPC),增強GABA能遞質的抑制效果[8]。

注:A為空白組(黑色曲線)與驚厥組(紅色與灰色曲線)小鼠海馬齒狀回顆粒細胞動作電位。驚厥組顆粒細胞放電增多(紅色曲線),灌流RTG可降低驚厥小鼠顆粒細胞的興奮性(灰色曲線);B為顆粒細胞輸入輸出曲線。驚厥組小鼠(紅色)顆粒細胞放電比空白組(黑色)增多。RTG可降低驚厥小鼠顆粒細胞的輸入輸出曲線,減少顆粒細胞放電(灰色);C為取B圖曲線中100 pA刺激電流強度所誘發的顆粒細胞動作電位個數,對比灌流RTG前后對顆粒細胞放電的抑制作用(紅色和灰色分別表示驚厥組小鼠同一顆粒細胞灌流RTG前后的放電情況)?？瞻捉M虛線表示該組平均值位置。B、C圖中每個點表示一個顆粒細胞。組間方差齊,空白組與驚厥組之間采用t檢驗,驚厥組與RTG組之間采用配對t檢驗。**為P<0.01。

基于以上機制,RTG通過抑制神經元放電從而發揮抗癲癇作用。從本研究的實驗結果來看,RTG雖然可以減少小鼠驚厥發作的等級及頻次,但不能完全消除發作。經過RTG處理的小鼠,仍然可出現3級以下發作。而苯巴比妥鈉的抗驚厥效果顯著,可以完全中斷小鼠的驚厥發作,從而使小鼠進入鎮靜麻醉狀態。然而,在海馬損傷方面,RTG的保護效果與苯巴比妥鈉相似,均可顯著減少海馬神經元的損傷。提示對于腦組織損傷而言,更重要的是及時中止高等級的發作。此外,苯巴比妥鈉可快速解除肢體陣攣,是臨床治療癲癇大發作的首選藥物,但由于其血藥濃度的不穩定性及肝損傷等副作用,故仍有待尋找既可有效抗癲癇發作而副作用又小的藥物來進行替代[11]。

顆粒細胞是海馬外電信號流入海馬的門控因素[21]。在驚厥小鼠模型中,顆粒細胞的興奮性增加,促進海馬外信息傳入海馬回路,引起海馬三突觸環路的過度激活,該過程是促進癲癇發生發展的重要機制[22]。本研究中全細胞電流鉗記錄顯示,急性驚厥小鼠海馬齒狀回顆粒細胞在RTG作用后電發放數量明顯減少。因此,應用RTG可以降低驚厥小鼠海馬齒狀回顆粒細胞的興奮性,有利于海馬內電活動的穩定。

綜上所述,RTG在急性驚厥模型小鼠中具有抗驚厥作用,對驚厥性海馬損傷具有較好的保護效果。其機制可能涉及對顆粒細胞興奮性的抑制,減少海馬內的興奮性損傷。