黃精雙向液體發酵的菌種優選及培養基優化研究

馬緒民，孫加龍，韓春超，顧正位

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2.泰安市東麒健康產業有限公司，山東 泰安 271000）

黃精（Polygonati Rhizoma）藥材來源于百合科黃精屬植物黃精，是傳統的藥食同源中藥，具有很好的藥用和食用價值［1-2］。 雞腿菇［Coprinus comatus（Muell.ex Fr.） Gray］，學名毛頭鬼傘，是16 種珍稀食用菌之一［3］。 蛹蟲草［Cordyceps militaris （L.） Link］，又稱北蟲草，為藥食兩用真菌，含有豐富的藥理活性物質，現代研究多集中于其保健和藥用方面［4-5］。秀珍菇［Pleurotus pulmonarius （Fr.） Quél］學名肺形側耳，又名小平菇，屬于食用真菌，具有豐富的營養價值［6-7］。

近年來，中藥雙向液體發酵技術受到了廣泛關注。 中藥液體發酵是將營養物質溶解在液體中制備培養基，隨后在其中接入菌種進行培養得到目標產物的發酵技術［8］。 雙向發酵是以中藥材為基質，以藥用或食用真菌作為發酵菌種，其中中藥材為真菌的生長提供營養，同時中藥材因真菌的分解作用而產生新的成分［9］。 本研究將二者結合，以雞腿菇、蛹蟲草、秀珍菇為發酵菌種，對黃精進行雙向液體發酵，通過考察菌絲體得率、抗氧化活性而優選出發酵黃精的最優菌種，并且對優選出的菌種液體培養基進行優化，為黃精深層次的開發以及增加雞腿菇發酵產物提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

雞腿菇菌種R2000，山東省農業科學院提供；蛹蟲草菌種CICC14013，山東省農業科學院提供；秀珍菇菌種LD1，山東省農業科學院提供。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海麥克林生物科技有限公司，CAS＃1898-66-4）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、羥自由基測定試劑盒（南京建成 生 物 工 程 研 究 所，A105/A018）；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；無水乙醇、葡萄糖、果糖、麥芽糖（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）；瓊脂、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酪蛋白胨（北京奧博星生物科技有限責任公司）；蔗糖、乳糖、KH2PO4、MgSO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 培養基

雞腿菇斜面培養基：20%土豆，2%葡萄糖，0.1%KH2PO4，0.1% MgSO4，2.5%瓊脂。 種子液培養基：20%土豆，2%麩皮，2%葡萄糖，0.1% KH2PO4，0.1% MgSO4。發酵培養基中基礎的碳源、氮源和磷酸鹽：2%葡萄糖，0.1% KH2PO4，1% MgSO4。

蛹蟲草斜面培養基同雞腿菇菌種。 種子液培養基：2%葡 萄 糖，1%蛋 白 胨，0.05% KH2PO4，0.05%MgSO4。 發酵培養基中基礎的碳源、氮源和磷酸鹽：2%葡萄糖，2%蛋白胨，0.05% KH2PO4，0.05% MgSO4。

秀珍菇菌種培養基同雞腿菇菌種。 種子液培養基：20%土豆，2%麩皮，0.5%蛋白胨，0.2% KH2PO4，0.049% MgSO4。 發酵培養基中基礎的碳源、氮源和磷酸鹽：2.5%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.102% KH2PO4，0.039% MgSO4。

1.3 儀器與設備

潔凈工作臺：SW-CJ-1D，上海蘇靜實業有限公司；高壓滅菌鍋：YX-280D，寧波久興醫療器械有限公司；分光光度計：UV-6100S，上海美譜達儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱：101，北京市永光明醫療儀器有限公司；電子天平：FA2004N，上海菁海儀器有限公司；恒溫振蕩：TS-2012C，上海印溪儀器儀表有限公司。

2 研究方法

2.1 菌種的發酵

從雞腿菇斜面培養基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體，勾取5 次。接種于種子培養基。26 ℃，160 r/min振搖4 d［10］。

從蛹蟲草斜面培養基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體，勾取3 次，接種于種子培養基，26 ℃，160 r/min振搖6 d，制備蛹蟲草種子液［11］。

從秀珍菇斜面培養基勾取約0.1 cm2菌落的菌絲體，勾取3 次，接種于種子培養基，26 ℃，160 r/min振搖11 d［12］。

3 種不同的真菌進行黃精雙向液體發酵，用500 mL 的錐形瓶，加入相應菌種發酵培養基中的基礎營養物質，裝樣量300 mL，黃精濃度7.5 mg/mL，接種量10%，溫度26 ℃。 雞腿菇160 r/min 振搖5 d，蛹蟲草靜置7 d，秀珍菇140 r/min 振搖7 d。 平行3次，將菌絲體抽濾，40 ℃烘干，稱量。

2.2 菌種的優選

將3 種菌絲體煎煮3 次，每次2 h，與發酵液混合，濃縮至20 mg/mL，作為最終的發酵產物，4 ℃保存備用。 干燥的黃精（40～60 目）與蒸餾水以1∶10 的比例煎煮3 次，每次3 h，濃縮至20 mg/mL 備用。

2.2.1 DPPH 自由基清除試驗［13］

按照表1 的操作步驟加入蒸餾水，無水乙醇，樣品和DPPH 混合均勻之后，避光反應30 min，于517 nm測吸光度（OD）值，按照下列公式計算清除率。

表1 DPPH 自由基清除試驗操作步驟

表2 黃精發酵后抗氧化活性（s）

表2 黃精發酵后抗氧化活性（s）

注：DPPH 為1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼。 與黃精水提液比較，＊P＜0.01。

組別 個數黃精水提液 3黃精雞腿菇發酵 3黃精蛹蟲草發酵 3黃精秀珍菇發酵 3 DPPH 自由基清除率/% 羥自由基抑制力/（U/mL） 總抗氧化能力/（U/mL）39.96±2.98 69.88±9.54 1.04±0.20 89.17±2.04＊ 78.12±9.02 9.37±1.56＊83.40±3.21＊ 29.84±3.13 2.15±0.64 92.15±0.76＊ 65.79±9.44 1.80±0.31

注：OD0 為空白參比吸光度值；OD1 為樣品與DPPH 自由基反應后的吸光度值；OD2 為樣品本身吸光度值。

2.2.2 羥自由基抑制能力測定［14］

按照羥自由基測定試劑盒（A018）說明書，用維生素C（VC）在相同濃度下對比。 取0.2 mL 樣品，于550 nm處，雙蒸水調零，測定OD 值，按照公式計算。

2.2.3 總抗氧化能力測定［15］

按照T-AOC 測定試劑盒說明書，用VC 在相同濃度下對比，取0.2 mL 樣品，于520 nm 處，雙蒸水調零，測定OD 值。 按照下列公式計算。

2.3 黃精液體發酵培養基的優化

2.3.1 黃精液體發酵質量濃度的考察

在基本營養成分不變的前提下，考察黃精質量濃度為0 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL 的液體發酵情況，每個濃度平行3 次，以生物量（g/L）為指標，優選黃精最佳的液體發酵濃度［16］。采用500 mL 的錐形瓶，裝樣量300 mL，140 r/min 振搖3 d，將菌絲體抽濾，40 ℃烘干，稱量。

2.3.2 碳源種類和含量的考察

參考張疏雨等［17］的方法，并做適當修改。 首先以相同濃度的2%的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和乳糖，每種碳源平行3 次，優選出碳源后再進行濃度的優化。 設置5 個濃度：0%、2%、4%、6%、8%。 用100 mL的錐形瓶，裝樣量50 mL，140 r/min 振搖3 d，將菌絲體進行抽濾，40 ℃烘干，稱量。

2.3.3 氮源種類和含量的考察

參考孟麗君等［18］的方法，并做適當修改。 首先以相同濃度的5%的麩皮、蛋白胨、酵母膏、酪蛋白胨和硫酸銨作為氮源，優選出氮源后再進行濃度的優化。設置5 個濃度：0%、2.5%、5%、7.5%、10%。 采用100 mL的錐形瓶，裝樣量50 mL，發酵3 d，平行3 次，將菌絲體抽濾，40 ℃烘干，稱量。

2.3.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，以合適的碳源、氮源以及黃精濃度作為試驗的三個因素，每個因素設三個水平，另外設置空白因素和空白水平項，設計L9（34）因素水平表，按照該表進行試驗，平行3 次，取平均值，以生物量（g/L）為指標，確定最優培養基配方［19］。見表3、表4。

表3 黃精雞腿菇發酵工藝因素水平

表4 黃精雞腿菇發酵正交試驗結果

2.4 統計學處理

3 結果與分析

3.1 菌絲體得率

以生物量（g/L）為縱坐標，黃精發酵后與普通發酵后生物量比較見圖1。 黃精均可使用3 種菌種進行液體發酵且發酵后菌絲體的得率均顯著增加，黃精雞腿菇液體發酵后生物量最多，為8.47 g/L，與自身普通發酵比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。 黃精蛹蟲草液體發酵后生物量增加的最多，發酵后生物量為7.56 g/L，與自身普通發酵比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 黃精發酵后菌絲體的得率

3.2 菌種的優選

由表2 可知，黃精和不同菌種液體發酵后，發酵后的產物DPPH 清除力比黃精水提液均有顯著增加。其中以秀珍菇發酵后DPPH 清除率最高，各發酵組與黃精水提液組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。在羥自由基清除試驗中，黃精經過蛹蟲草和秀珍菇發酵后，羥自由基抑制能力反而有顯著降低，黃精雞腿菇發酵后略有上升，可達到（78.12±9.02）U/mL。在總抗氧化能力方面，經過發酵后，黃精雞腿菇發酵比黃精水提液顯著增強，兩組療效比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。

綜合考慮，選擇雞腿菇對黃精進行液體發酵，并對其液體發酵培養基進行優化。

3.3 黃精液體發酵培養基的優化

3.3.1 黃精發酵濃度

以生物量（g/L）為縱坐標，結果見圖2-A，黃精在發酵質量濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL 時，生物量比普通發酵顯著性增加，10 mg/mL 時生物量最多。 因此，并不是黃精濃度越大提供的營養越多，真菌生長最好。

圖2 培養基條件單因素考察

3.3.2 碳源的種類和濃度

以生物量（g/L）為縱坐標，結果見圖2-B。果糖和乳糖作為碳源時，其生物量比其他碳源的顯著減少，生物量最大的碳源是葡萄糖，因此選擇葡萄糖作為黃精液體發酵培養基中的碳源。

以生物量（g/L）為縱坐標，結果見圖2-C。當葡萄糖含量太高時，其生物量反而顯著減少；當葡萄糖含量為0%和2%時，其生物量相差不大；0%的葡萄糖含量時，黃精發酵生物量反而高。

3.3.3 氮源種類和濃度

以生物量（g/L）為縱坐標，結果見圖2-D，麩皮作為氮源時，生物量最多，酵母膏、硫酸銨和酪蛋白胨作為氮源時生物量顯著減少，因此麩皮更適合應用在黃精液體發酵中。

以生物量（g/L）為縱坐標，結果見圖2-E，與不加麩皮比較，其他含量時的黃精發酵生物量均顯著增加，麩皮5%的含量時生物量最多，濃度增大時生物量趨于平緩。

結果如表4 所示，各因素對黃精液體發酵培養影響的順序為：黃精濃度＞氮源含量＞碳源含量。由表5 方差分析數據可知，氮源和黃精濃度對黃精雞腿菇發酵具有顯著影響，而碳源的含量則對其雙向液體發酵工藝無顯著影響。 由分析結果可知，最佳培養基為葡萄糖0%，麩皮含量為5%，黃精質量濃度為10 mg/mL，土豆20%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，按照該條件進行發酵，進行驗證試驗，菌絲體得率為（8.06±0.20）g/L。

表5 黃精雞腿菇發酵不同工藝因素水平下方差分析結果

4 討論

黃精在用三個菌種進行雙向液體發酵后，生物量均有顯著增加，以雞腿菇為菌種進行發酵時，菌絲體得率最高。 此外，雞腿菇-黃精液體發酵后DPPH清除率和總抗氧化能力較其他菌種發酵后高，且羥自由基抑制能力也略有提高。 因此綜合考慮選擇雞腿菇作為對黃精進行液體發酵的菌種。

真菌的生長繁殖離不開適宜的生長條件，在合適的生長條件下，真菌的生長代謝活動才能正常進行［20］。 各種營養是微生物生長的先決條件，并且各種營養物質只有在適宜的濃度時才能對真菌的生長繁殖起到最佳效果。 所以培養基的優化需要在單因素的基礎上通過正交試驗篩選出營養物質的最佳配比。 結果表明，最佳培養基為葡萄糖0%，麩皮含量5%，黃精質量濃度10 mg/mL，土豆20%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%。 此外由單因素結果可知，當黃精含量持續升高時，生物量反而降低，說明并不是黃精含量越多發酵過程越好，黃精-雞腿菇雙向發酵應在適宜的含量范圍內進行，超出一定的限度反而會阻礙發酵過程。

由正交試驗結果猜測，黃精在液體發酵過程中，其水提液為雞腿菇的生長繁殖提供了一定的基礎營養物質，特別是碳源所具備的營養，此過程符合中藥雙向液體發酵的定義。 此外，黃精和雞腿菇中的主要成分為多糖類物質，相關研究表明黃精多糖和雞腿菇多糖具有很好的抗氧化作用［21-22］。 在雞腿菇發酵黃精后抗氧化能力顯著提升，說明發酵后的產物具有更好的抗氧化能力，原因可能是發酵后產生了具有良好抗氧化能力的多糖。 本研究為開發黃精發酵產品提供了新思路，為接下來雞腿菇雙向發酵黃精在保健品和化妝品領域的應用提供了一定參考。但是對于雞腿菇發酵黃精后新產生的活性物質還有待進一步的研究和探索，這也是日后研究工作的重點關注內容。