參芪復方對衰老糖尿病模型大鼠骨骼肌蛋白質合成代謝及mTOR 信號通路的影響

田 苑，鐘 文，楊 燕

（1.成都醫學院，四川 成都 610500； 2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072）

衰老是肌少癥最根本的因素，伴隨年齡增加的不可避免的肌量損失和功能下降可導致原發性肌少癥［1-2］。 糖尿病是引發繼發性肌少癥的重要病因，糖尿病能加速因葡萄糖毒性、胰島素抵抗以及某些遺傳因素導致的肌肉損失［3］。 骨骼肌作為重要的糖代謝器官，其肌量的喪失會導致嚴重的全身代謝紊 亂［4］。

肌少癥可導致跌倒、骨折、功能下降、老年人失去獨立性等，也能增加死亡率［5］。 衰老和糖尿病的各種病理因素導致骨骼肌肌量丟失、功能減退，使衰老糖尿病肌少癥成為一種普遍的共病狀態，對老年人生活質量和生命安全造成不可忽視的危害，帶來巨大的醫療和經濟負擔。 最新的《中國老年糖尿病診療指南（2021 年版）》中也明確將“肌少癥與衰弱”列為老年糖尿病共患疾?。?］。 骨骼肌是調節葡萄糖和蛋白質代謝的重要器官，保護骨骼肌肌量和功能，能夠阻止老年衰弱狀態和肌少癥，遏制老年性代謝疾病的發生發展。

肌量減少是肌少癥的核心診斷標準，骨骼肌蛋白質合成和分解代謝的平衡是肌量的保證。 本研究基于中醫脾主肌肉理論，探討中藥參芪復方調控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，干預衰老糖尿病大鼠肌量減損的分子機制，以期為中醫藥防治糖尿病肌少癥提供新的思路。

1 材料

1.1 實驗動物

3 月齡健康無特定病原體（SPF 級）Wistar 雄性大鼠50 只，體質量200～250 g，成都達碩實驗動物公司，許可證號為SCXK（川）2015-030，實驗動物福利倫理審核申請備案編號為2019-25。 動物飼養區域通風、控溫、控濕，溫度22～23 ℃，濕度55%～56%。實驗動物分籠飼養，3～5 只/籠。 飼養環境保持清潔干燥，定期消毒。 實驗區黑暗與光照交替時間為每12 h 一次。

1.2 主要試劑與儀器

參芪復方組成：人參、黃芪、山藥、生地黃、山萸肉、天花粉、丹參、制大黃，成人一日劑量：人參、黃芪均15 g，大黃6 g，余皆為10 g。 制備參芪復方浸膏，每毫升含1.44 g 生藥，由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科生產提供。 磷酸西格列汀片（西格列?。好科?00 mg，默沙東公司，批號J20140095。 磷酸西格列汀混懸液：將西格列汀片研成細末，加蒸餾水30 mL 混勻制備混懸液。 D-半乳糖：SIGMA 公司，貨號G0750-50G。 鏈脲佐菌素（STZ）：MAYA 公司，貨號833208-14684-1G。 mTOR 通路磷酸化懸浮芯片：Full Moon 公司，芯片貨號PMT138。 乙二胺四乙酸（EDTA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號E196386。 考馬斯亮藍G-250：北京索萊寶科技有限公司，貨號C8420。 牛血清血蛋白BSA：Merck 公司，貨號A1933-25G。 三氯乙酸（TCA）：上海麥克林生化科技有限公司，貨號T834457。

數顯恒溫水浴鍋：上海昕儀儀器儀表有限公司，型號XY-SYG-14。 冷凍離心機：Thermo Scientific 公司，型號Heraeus Pico & Fresco。 超速離心機：Thermo Scientific 公司，型號Sorvall WX 80+。 超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設備有限公司，型號JP-720PLUS。高通量組織研磨器：寧波新芝生物科技有限公司，型號Sceintz-48。

2 方法

2.1 分組與造模

50 只Wistar 雄性大鼠適應性喂養1 周，8 只大鼠以生理鹽水腹腔注射，為空白組；另10 只腹腔注射D-半乳糖（50 mg/kg，日1 次）42 d，為衰老模型組；另外32 只大鼠腹腔注射D-半乳糖42 d，并于第13 天喂養高脂高糖飼料，30 d 后腹腔一次性注射STZ（40 mg/kg），篩選空腹血糖（FPG）≥11.1 mmol/L 者為衰老糖尿病模型鼠。 空白組及衰老模型組以同等容量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射作為對照。

衰老糖尿病模型大鼠按照血糖由高到低進行排列并編號，采用隨機數字表法分為衰老糖尿病模型組、參芪復方組、西格列汀組。 分組后衰老糖尿病模型組和西格列汀組各11 只，參芪復方組10 只，加空白組8 只，衰老模型組10 只，共5 組。

2.2 干預

造模后進行藥物干預，干預時長為8 周。 空白組、衰老模型組及衰老糖尿病模型組灌服生理鹽水，參芪復方組和西格列汀組的給藥劑量相當于成人劑量的10 倍，每周測量大鼠體質量，并根據體質量變化，及時調整灌胃藥量。 各組具體給藥方案見表1。

表1 各組大鼠給藥方案

2.3 標本采集與處理

大鼠處死前12 h 禁食不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉，置于冰盤四肢固定。 將腓腸肌自起點（股骨內、外側髁）至止點（跟骨結節處）完整取下。 在磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗凈血跡洗3 次，用剪刀剪碎腓腸肌，然后置于離心管中加入5%預冷緩沖液至浸沒，待測肌纖維與肌漿蛋白含量，在保證統計量有效的前提下，每組取3 只樣本；余腓腸肌組織分裝至微型離心管（EP 管）并標記，放置于液氮中，存放溫度為-80 ℃，用于蛋白磷酸化抗體芯片檢測。

3 統計學方法

統計分析軟件為SPSS 22.0，計量資料以x±s 表示，各組數據分別進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法；不符合方差齊性要求則進行秩和檢驗。 取α=0.05 為檢驗水準。

4 結果

4.1 各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質量濃度比較

各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質量濃度比較，差異無統計學意義。 見表2。

表2 各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質量濃度比較（）

表2 各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質量濃度比較（）

組別 n 肌纖維蛋白質量濃度/（μg/mL）空白組 3 75.65±0.42衰老模型組 3 75.37±1.11衰老糖尿病模型組 3 74.27±1.74參芪復方組 3 74.50±0.79西格列汀組 3 75.20±0.95

4.2 各組大鼠腓腸肌肌漿蛋白質量濃度比較

結果顯示，衰老糖尿病模型組大鼠骨骼肌肌漿蛋白質量濃度顯著降低。 與衰老糖尿病模型組比較，參芪復方組和西格列汀組都能提高衰老糖尿病模型大鼠的腓腸肌肌漿蛋白質量濃度。 見表3。

表3 各組大鼠腓腸肌肌漿蛋白質量濃度比較（）

注：與衰老糖尿病模型組比較，＊P＜0.05。

組別 n 肌漿蛋白質量濃度/（μg/mL）空白組 3 71.70±0.90＊衰老模型組 3 71.13±1.59＊衰老糖尿病模型組 3 60.28±7.01參芪復方組 3 70.72±2.00＊西格列汀組 3 67.29±4.06＊

4.3 mTOR 磷酸化抗體芯片磷酸化位點圖像

蛋白激酶B1（Akt1，Phospho-Thr450）、核糖體蛋白S6 激酶1/2/3/4（RSK1/2/3/4，Phospho-Ser221/227/218/232）及p70 核糖體蛋白S6 激酶（P70S6K，Phospho-Thr229）在衰老糖尿病模型組下調，在參芪復方組和西格列汀組均上調；人第10 號染色體缺失的磷酸酶（PTEN，Phospho-Ser370）在衰老糖尿病模型組上調，在參芪復方組和西格列汀組下調。 見表4、圖1。

表4 mTOR 磷酸化抗體芯片讀取的組間比較FC 值

5 討論

5.1 病機及治則

脾主肌肉。 《素問·太陰陽明論》載：“脾病四肢不用何謂也……今脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟水谷之氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉皆無氣以生，故不用焉?！毖悦髌⑦\化不利，不能為胃行其津液，不能運化水谷精微以達四末，四肢不得稟水谷之氣，致四肢脈道、筋骨、肌肉“無氣以生”，失于氣血之濡養，萎廢不用。 脾主運化水谷精微功能受損，則四肢筋骨肌肉失于水谷精微、氣血的滋養，導致骨骼肌肌量受損，出現肌肉瘦削、乏力、運動障礙、易跌倒等表現，如《靈樞·本神》言：“脾氣虛則四肢不用?！惫署舨”旧碓从谄⑻撌н\，脾虛失濡，治療尊“治痿獨取陽明”，當健脾助運。

糖尿病歸屬中醫學消渴范疇。 葡萄糖作為水谷精微之一，需脾運化至身體各處而被利用，施今墨言：“血糖者，飲食所化之精微也?！保?］脾的功能障礙則“脾不散精”或“散精不利”，導致葡萄糖不能被運化和利用，在血液中積累，形成糖尿病之高血糖。 故消渴的核心病機為脾氣虛、脾不散精，健脾益氣也同為消渴的治療方法［8］。 消渴相關肌病以消渴為獨特病因，病機同為脾氣不足，治療首當健脾益氣。

肌少癥是增齡性疾病，老年人為主要發病人群。老年人腎氣虛，更賴脾胃化生氣血以滋五臟，故衰老消渴相關肌病的治療仍以益氣健脾、助脾運化散精為要，兼顧補腎，健脾補腎并行［9］。 脾氣不足，病理產物叢生，其中瘀血貫穿消渴始終，也是促進肌病發生發展的重要環節。 衰老消渴相關肌病的治療方法為健脾益氣、滋陰補腎、活血化瘀。

5.2 前期研究基礎

參芪復方是臨床治療消渴的經驗方，該方可改善大鼠的一般狀況，降低大鼠食欲并減少飲水量，維持腓腸肌濕重，改善骨骼肌細胞炎癥浸潤、萎縮、水腫情況，其中對炎癥細胞浸潤的改善尤為明顯［10-11］，并能顯著升高血清胰島素樣生長因子1（IGF-1）水平。前期研究還顯示，參芪復方維持骨骼肌肌量的作用可能與磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR 通路的激活相關［10，12］。

5.3 實驗結果分析

骨骼肌蛋白質合成是維持肌量、肌力的關鍵因素。 本實驗結果顯示，參芪復方組肌漿蛋白含量顯著高于衰老糖尿病模型組，組間比較差異有統計學意義。 肌漿蛋白是與能量代謝功能有關的蛋白質，占肌肉蛋白質的30%～35%，參芪復方升高肌漿蛋白質量濃度證明其可能通過促進蛋白質的合成以保持肌量。

mTOR 信號通路磷酸化抗體芯片數據讀取結果顯示，參芪復方上調Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）。 Akt 介導的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）激活通過磷酸化調節許多下游效應蛋白，包括具有良好特性的效應因子p70 核糖體S6 蛋白激酶1（P70S6K1）和真核細胞翻譯起始因子4E 結合蛋白1（4E-BP1），以增加蛋白質合成［13］。 從Akt 激酶被磷酸化的順序來看，蘇氨酸450 號位點的磷酸化優先于絲氨酸473 號位點和蘇氨酸308 號位點的磷酸化，而且已經被證明蘇氨酸450 號位點的磷酸化是接下來繼續磷酸化和激活Akt 激酶所必需的［14］。 P70S6K 的磷酸化增加，能夠促進骨骼肌蛋白質合成，mTORC1/P70S6K 信號通路的磷酸化是一種促進骨骼肌蛋白質合成的重要因素［15］。 在IGF-1/Akt/mTORC1 信號通路中，Akt/mTOR 激活和P70S6K的后續磷酸化被認為是誘導蛋白質合成的原因［16］。RSK 已被證明是磷酸化160 kDa 的Akt/PKB 底物（AS160），AS160 是一種參與介導葡萄糖轉運蛋白-4（GLUT4）轉運到質膜以響應胰島素的蛋白質［17］，RSK 磷酸化AS60，從而促進分子內GLUT4 蛋白向細胞膜遷移，促使葡萄糖從血液吸收到肌肉中儲存和/或利用。 在骨骼肌中，胰島素通過將GLUT4 葡萄糖轉運體從細胞內轉移到肌細胞膜上，刺激葡萄糖攝取，并增加肌肉質量和生長［18］。 Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）的表達上調都能促進骨骼肌蛋白質的合成。

參芪復方可下調PTEN（Phospho-Ser370），PTEN作為胰島素及IGF-1 信號調節器的作用，影響葡萄糖攝取和脂質代謝，PTEN 表達增加可負性調節胰島素敏感性，并參與胰島素抵抗的發生［18］。 參芪復方可能通過下調PTEN（Phospho-Ser370），改善衰老糖尿病大鼠的糖脂代謝。

綜上，參芪復方通過升高肌漿蛋白質量濃度，促進蛋白質的合成以保持肌量，其分子機制可能與mTOR信號通路中Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）的上調有關。

5.4 小結

脾主肌肉，肌肉形態結構和生理功能的正常，都與脾胃密切相關。 脾胃功能正常發揮更是延緩衰老、防治消渴及其并發癥的根本。 mTOR 信號通路是調節蛋白質穩態的重要通路，通過感受能量代謝和運動刺激，參與調節蛋白質的合成代謝，進而維持骨骼肌肌量和肌力。 脾胃主運化受納，將外來攝入的飲食水谷轉化為精微的能量物質，布散于四肢肌肉，使四肢得以充養。 綜上實驗結果可知，參芪復方可能通過干預mTOR 信號通路、調控骨骼肌蛋白質合成代謝、維護骨骼肌能量代謝、保護骨骼肌肌量及肌力，而發揮防治衰老相關糖尿病肌少癥作用。