牡丹野生種根際土壤細菌群落特征分析

郭麗麗,張晨潔,王 菲,沈佳佳,張凱月,何麗霞,郭 琪,侯小改*

(1.河南科技大學農學院/牡丹學院,河南 洛陽 471023;2.河南科技學院資源與環境學院,河南 新鄉 453003;3.甘肅省農業技術推廣總站,甘肅 蘭州 730020)

牡丹(Paeonia×suffruticosa)屬芍藥科芍藥屬牡丹組(Sect.Moutan)多年生木本植物。根據花盤質地和形態可分為革質花盤亞組和肉質花盤亞組,革質花盤亞組包括1個栽培種牡丹和5個野生種,即卵葉牡丹(P.qiui)、稷山牡丹(P.jishanensis)、楊山牡丹(P.ostii)、紫斑牡丹(P.rockii)、四川牡丹(P.decomposita);肉質花盤亞組包括4個野生種,即紫牡丹或稱滇牡丹(P.delavayi)、黃牡丹(P.lutea)、狹葉牡丹(P.potanini)和大花黃牡丹(P.ludlowii)[1]。牡丹組的9個野生種均為我國特有種[1],是雜交育種的親本來源[2],在系統演化、生物多樣性保護、新品種培育和改良等研究中具有重要作用,同時也具有極高的觀賞價值、經濟價值與科學研究價值[3-6]。

根際是土壤、根系以及微生物三者之間相互作用的關鍵區域[7],根際土壤微生物數量龐大,群落豐富且功能多樣[8],在促進土壤養分轉化、物質循環、能量流動等過程中發揮著重要作用[9-11]。在環境變化、人為干擾等多因素的影響下,根際土壤微生物群落常處于動態變化的過程中[12],其與植物之間的相互作用在植物生長發育中發揮積極作用,能夠提高植物對環境的適應性和抗性[13]。因此,探究根際土壤微生物的群落結構和組成有利于理解土壤生態系統對植物生長和健康的影響[14]。

目前,關于牡丹根際微生物群落結構的研究相對較少,而且主要集中在栽培品種上,如耿曉東等[15]發現不同種植年限‘鳳丹’(P.ostii‘Feng Dan’)根際真菌群落多樣性表現為6年生>3年生>10年生;李昱瑩等[16]報道了不同種植年限‘鳳丹’根際土壤真菌群落多樣性為10年生>5年生>32年生>4年生>2年生,而‘鳳丹’根際土壤細菌多樣性則隨種植年限的延長而呈下降趨勢[17]。此外,牡丹根際土壤中微生物總數量大于非根際土壤,其中細菌占主要優勢[18]。Xue等[19]報道了牡丹種植年限和栽培品種對土壤微生物群落結構的影響。Yang等[5]對牡丹根和葉內生細菌多樣性進行了分析,結果表明‘雪蓮’(P.rockii‘Xuelian’)、‘花王’(P.suffruticosa‘Kaoh’)和‘正午’(P.suffruticosa×P.delavayivar.lutea‘High Noon’)牡丹根內細菌的OTU豐度高于葉內,優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。利用Illumina高通量測序技術對4個種源地四川牡丹根際土壤微生物和種子內生菌的組成研究發現,同一種源地根際土壤和種子中有70%以上的相同細菌序列,而相同的真菌序列最高約50%,且土壤有機碳、氮、磷含量等性質均會對根際土壤微生物及內生菌的組成結構產生一定影響[20]。大量研究表明牡丹根際微生物對維持牡丹健康和土壤肥力具有重要的生態學意義[5, 19, 21-23]。然而,牡丹野生種根際土壤微生物群落結構和多樣性的研究尚鮮見報道。

本研究結合MiSeq高通量測序技術和生物信息學方法,對引種地的9個牡丹野生種根際土壤細菌群落特征進行分析,探究其根際土壤微生物群落結構和多樣性與土壤理化性質的關系,旨在挖掘和培育有利于牡丹野生種健康生長的根際微生物菌群,為開展牡丹種質資源保護、新品種培育和種質創新提供理論基礎和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 牡丹野生種基本信息

本研究選取9個牡丹野生種,分別于1992年(大花黃牡丹)、1998年(稷山牡丹、紫斑牡丹、四川牡丹、狹葉牡丹、紫牡丹和黃牡丹)和1999年(卵葉牡丹和楊山牡丹)從西藏林芝、山西稷山縣、甘肅子午嶺林區、四川馬爾康縣、四川雅江縣、云南麗江、云南中甸縣、湖北神農架和河南楊山引種到甘肅省農業技術推廣總站(103°88′E,36°05′N),并采用統一的施肥、灌溉等措施對其進行日常管理。

1.2 根際土壤的采集

本研究所用的9種牡丹的根際土壤樣品于2019年采自甘肅省農業技術推廣總站。牡丹根際土壤采集方法參考Han等[24]方法,即每個野生種隨機選取3株長勢一致的植株,去除土壤表層植物殘體,在每株牡丹主莖四周10 cm處利用土鉆采集5個樣點的土壤,每個采樣點取1芯(直徑5 cm,深度20 cm)?；靹蚝蟀此姆址ㄊ占s200 g根際土壤并分為兩份,其中一份置于-80 ℃冰箱保存,用于微生物群落特征的分析;另一份置于室內風干,用于土壤性質測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取和PCR擴增

采用EZNA?Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek,USA)對采集的27份根際土壤樣品進行微生物組總DNA的提取,通過1%(質量分數,下同)瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(IMPLEN,德國)檢測DNA的質量和純度,高質量DNA樣品置于-20 ℃儲存備用。以細菌16S rRNA基因V3+V4區域338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)為引物[25],微生物總DNA為模板,使用Phusion酶進行PCR擴增,PCR反應體系如下:Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL、引物338F和806R各2.5 μL、DNA模板50 ng、加ddH2O至25 μL;反應條件為98 ℃ 30 s、98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、35個循環,72 ℃ 10 min,4 ℃保存。通過PCR在目標區域擴增產物上添加測序通用接頭和樣本特異性Barcode序列。PCR擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,使用AMPure XT beads回收試劑盒對目標片段進行回收,具體步驟參考試劑盒中的操作說明。

1.3.2 高通量測序

純化后的PCR產物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒在Promega QuantiFluor熒光定量系統上對文庫進行定量、混庫。利用Illumina測序平臺250 PE(杭州聯川生物技術股份有限公司)及按照標準操作進行雙端測序。

1.3.3 生物信息學分析

在特定的過濾條件下對原始數據進行質量過濾,使用Vsearch軟件(V2.3.4)過濾嵌合體序列并進行質控分析,獲得最終數據。使用Blast分類比對軟件進行物種分析,使用UPARSE 8.0按照相似度97%將序列聚類成操作分類單元(OTUs),通過核糖體數據庫項目(RDP)分類器將分類注釋分配給每個OTU的代表性序列。所獲得的細菌16S rRNA基因序列保存在國家生物技術信息序列讀取檔案中心(登記號PRJNA760268)。

1.3.4 根際土壤性質的測定

根際土壤樣品經風干后,分別過0.150和0.850 mm篩以供土壤指標的測定。使用土壤酸堿度計進行土壤pH的測定,土壤有機質含量(soil organic matter,SOM)采用重鉻酸鉀滴定法測定,全氮含量(total nitrogen,TN)采用半微量開氏法測定,速效磷含量(available phosphorous,AP)采用0.5 mol/L NaHCO3浸提和鉬銻抗比色法測定,速效鉀含量(available kalium,AK)采用1 mol/L的NH4OAc浸提和火焰光度法測定[26]。

1.4 數據分析

對9個牡丹野生種根際土壤細菌的Alpha多樣性(Chao1豐富度估計量、物種豐富度指數、測序深度指數、Shannon多樣性指數、Simpson多樣性指數)進行分析,以表示細菌種群的豐富度、多樣性、優勢度和均勻度。采用SPSS 26.0進行Beta多樣性分析,其基于距離矩陣的主坐標分析(PCoA)以評價細菌群落的差異。采用OmicStudio(https://www.omicstudio.cn/tool)工具進行LEfSe(LDA Effect Size)分析用于驗證樣本中不同根際土壤細菌類群的差異性。利用OmicStudio工具中PICRUSt2功能預測云分析對9個野生種根際土壤細菌群落的功能進行預測。

采用SPSS 26.0對土壤性質的數據進行統計和單因素(One-way ANOVA)方差分析,通過新復極差法(Duncan)來比較各處理間差異的顯著性,使用OmicStudio工具對優勢細菌的相對豐度和土壤性質進行相關分析和冗余分析(redundancy analysis,RDA)并作圖,利用Origin 2018進行作圖。

2 結果與分析

2.1 牡丹野生種根際土壤性質特征

由牡丹根際土壤的性質(表1)可知,牡丹野生種在其引種地根際土壤pH分布在8.16～8.44,其中楊山牡丹根際土壤pH最高,與其他種呈顯著差異(P<0.05);其次是狹葉牡丹、四川牡丹、紫斑牡丹、稷山牡丹和大花黃牡丹;黃牡丹、卵葉牡丹和紫牡丹的根際土壤pH最小,且與狹葉牡丹根際存在顯著差異(P<0.05)。9種野生牡丹根際土壤有機質含量不同,四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤有機質含量最高,黃牡丹、狹葉牡丹和稷山牡丹根際土壤含有的有機質最少,前兩種與后3種間存在顯著差異(P<0.05)。四川牡丹和黃牡丹根際土壤全氮含量最高,且顯著高于紫斑牡丹和狹葉牡丹(P<0.05)。根際土壤速效磷含量表現為黃牡丹>卵葉牡丹>楊山牡丹>大花黃牡丹>狹葉牡丹>紫斑牡丹>四川牡丹>稷山牡丹>紫牡丹。大花黃牡丹根際土壤中速效鉀含量最高,顯著高于其他種;其次為黃牡丹與紫牡丹,顯著高于除大花黃牡丹外的其他種;卵葉牡丹和狹葉牡丹根際土壤中速效鉀含量顯著低于除楊山牡丹外的其他種(P<0.05)。

表1 牡丹野生種根際土壤的理化性質

2.2 根際土壤細菌群落結構與組成

9個牡丹野生種根際土壤細菌16S rDNA測序共獲得606 536個原始序列片段,共計247.71 Mb。其中長度小于200 bp序列片段有3 997條,≥200～300、≥300～400、≥400～500 bp分別有5 558、165 721、431 260條。這些序列依次聚類到3 168、2 604、1 903、1 713、3 702、3 217、580、853和2 291個OTU單元。

2.2.1 多樣性分析

在相似性≥97%的水平上對各樣品的有效序列進行OTU聚類,篩選出OTUs的代表性序列,共獲得60 092個OTUs,并利用R程序制作花瓣圖(圖1)。由圖1可知,9個野生種樣品所含OTU數目均由特異OTU數目和共有OTU數目組成,重疊區包含377個共有OTU數目。各樣品所含特異OTU數目以稷山牡丹最多(114個),四川牡丹最少(18個)。

圖1 牡丹野生種根際土壤樣品的OTU分析Fig.1 OTU analysis of rhizosphere soil samples of wild tree peony

對牡丹土壤根際細菌群落進行Alpha多樣性分析結果見表2。Chao1豐富度估計量和物種豐富度指數主要反映樣本的物種豐富度信息,估計群落中包含物種的數目,由表2中Chao1和物種豐富度結果可知,9個牡丹野生種中楊山牡丹根際土壤細菌群落包含的物種數目最高,紫牡丹和稷山牡丹兩個種根際土壤樣本中物種數目含量最少,與除卵葉牡丹外的其他種間存在顯著性差異(P<0.05)。Shannon和Simpson多樣性指數同時反映樣品中物種種類的數目,以及樣品中不同種類的物種豐度的平均性或均勻性,在相同的測序深度下,狹葉牡丹、楊山牡丹、四川牡丹、大花黃牡丹、紫斑牡丹和黃牡丹根際土壤細菌的Shannon和Simpson多樣性指數較高,且與紫牡丹和稷山牡丹差異顯著,表明6個牡丹野生種多樣性較其他種更高。測序深度指數能夠反映樣本低豐度OTU覆蓋情況,9個樣本的數值均大于0.85,表明測序深度已基本覆蓋到樣品中所有種,樣本所構建的細菌文庫能夠比較有效地反映其多樣性。

表2 牡丹野生種根際土壤樣品的Alpha多樣性分析

通過PCoA(圖2)分析發現,各樣本細菌群落組成具有明顯差異。其中四川牡丹、紫斑牡丹、黃牡丹、楊山牡丹、狹葉牡丹和大花黃牡丹分布距離較近,說明其根際土壤中細菌群落結構相似;稷山牡丹、紫牡丹和卵葉牡丹與其他6組分布距離較遠,表明三者根際土壤中細菌群落差異顯著。

圖2 基于Weight-UniFrac方法的牡丹野生種根際土壤樣品PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of rhizosphere soil samples of wild tree peony based on the Weight-UniFrac method

2.2.2 細菌群落結構組成分析

基于OTU分類結果,9個牡丹野生種根際土壤細菌16S rRNA基因序列被分為24門、84綱、154目、280科和603屬。

9個牡丹野生種根際土壤樣本的細菌群落微生物多樣性的整體分布結果表明:在門水平上(表3),根際土壤樣本的核心優勢細菌群落主要由變形菌門(Proteobacteria,相對豐度9.35%～34.20%)、酸桿菌門(Acidobacteria,相對豐度12.59%～35.61%)、放線菌門(Actinobacteria,相對豐度9.07%～42.13%)和綠彎菌門(Chloroflexi,相對豐度3.12%～17.44%)組成,總占比為79.96%,剩下的14.21%涉及19個門。其中,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,相對豐度0.53%～4.71%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,相對豐度1.06%～5.49%)、厚壁菌門(Firmicutes,相對豐度0.58%～12.83%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae,相對豐度0.28%～2.58%)、疣微菌門(Verrucomicrobia,相對豐度0.38%～1.72%)也表現出了較高的相對豐度。有5.83%的序列在門水平上不能進行分類。

在門水平上的單因素方差分析結果表明,不同細菌在不同牡丹野生種根際土壤中豐度存在顯著差異。變形菌門在紫牡丹和稷山牡丹中豐度顯著低于除卵葉牡丹外的其他種(P<0.05);酸桿菌門在四川牡丹中豐度最高,在紫牡丹和稷山牡丹中豐度較低,兩者存在顯著差異(P<0.05);紫牡丹和稷山牡丹中放線菌門豐度顯著高于除卵葉牡丹外的其他種(P<0.05);綠彎菌門在紫牡丹中豐度最高(P<0.05),和四川牡丹、黃牡丹根際中豐度存在顯著差異(P<0.05);四川牡丹、楊山牡丹和狹葉牡丹中芽單胞菌豐度較高,與紫牡丹和稷山牡丹存在顯著差異(P<0.05);擬桿菌門在大花黃牡丹根際土壤中豐度最高,在卵葉牡丹、稷山牡丹和紫牡丹中豐度較低,前者與后三者間存在顯著差異(P<0.05);厚壁菌門在稷山牡丹中豐度最高,與其他8個種差異顯著(P<0.05);硝化螺旋菌門在大花黃牡丹根際土壤中豐度最高,在紫牡丹中豐度最低;疣微菌門在紫斑牡丹中豐度最高,在四川牡丹和稷山牡丹中豐度最低,差異顯著(P<0.05)。

2.3 牡丹9個野生種根際土壤細菌差異分析

LEfSe分析結果(圖3)表明,四川牡丹根際細菌群落中硝化螺旋菌門、酸桿菌門、貪銅菌屬(Cupriavidus)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、Gp22、Gp4、Gp17和Gp4等相對豐度較高且具有統計學意義;紫牡丹中綠彎菌門、放線菌門、小單孢菌屬(Micromonospora)、暖繩菌屬(Caldilinea)等存在顯著差異;在大花黃牡丹中起到重要作用的細菌類別為硝化螺旋菌門、黃桿菌屬(Flavobacterium)、嗜熱光合細菌屬(Roseiflexus)、根瘤菌屬(Chelativorans)和Gp3;黃牡丹中起到重要作用的細菌為變形菌門、甲基彎菌屬(Methylosinus)和假單胞菌屬(Pseudomonas);楊山牡丹中為芽單胞菌門;卵葉牡丹中馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)相對豐度較高。

不同的圈層從內向外輻射,代表物種的7個分類級別,每個節點代表該級別下的物種分類;彩帶的顏色代表植物種;不同節點的字母代表的具體細菌種類標記在圖的右側。Different circles radiate from inside to outside, representing seven classification levels of species, and each node represents the classification of species under this level; the color of the ribbon represents the plant species; the bacterial species represented by the letters of different nodes are marked on the right side of the figure.

2.4 牡丹9個野生種根際土壤細菌功能預測

利用PICRUSt軟件進行細菌功能預測。選取豐度排名前35的第3層級功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖(圖4)。不同樣本根際細菌群落的功能預測多集中在代謝、遺傳信息處理和環境信息處理相關通路上,如轉錄因子、一般功能預測、ABC轉運體、DNA修復和重組蛋白、雙組分系統、分泌系統、核糖體、嘌呤代謝、未知功能、細菌運動蛋白、轉錄因子、肽酶、嘧啶代謝、氨基酸相關酶、染色體、核糖體合成、其他離子偶聯轉運蛋白、氧化磷酸化、精氨酸和脯氨酸代謝、丙酮酸代謝、原核生物中的碳固定途徑等。與紫牡丹、黃牡丹和大花黃牡丹相比,楊山牡丹根際細菌中差異功能最為顯著,狹葉牡丹次之。

色帶相應顏色與熱圖矩陣數據相映射,靠近正值顏色(紅色)即為正相關,靠近負值顏色(藍色)即為負相關。The corresponding color of the color band is mapped to the heat map matrix data, and the color close to the positive value (red) is positive correlation and the color close to the negative value (blue) is negative correlation.

2.5 土壤環境因子與根際土壤細菌群落的關系

相關性分析(圖5)發現,牡丹根際土壤有機質含量與細菌中變形菌門、酸桿菌門、匿桿菌門和纖維桿菌門(Fibrobacteres)相對豐度呈極顯著正相關(P<0.01),與芽單胞菌門和硝化螺旋菌門相對豐度呈顯著正相關(P<0.05);與放線菌門、綠彎菌門和candidatus Saccharibacteria相對豐度呈極顯著負相關(P<0.01),與厚壁菌門(Tenericutes)呈顯著負相關(P<0.05)。土壤速效鉀含量與擬桿菌門相對豐度呈極顯著正相關(P<0.01),與變形菌門和硝化螺旋菌門相對豐度呈顯著正相關(P<0.05);與放線菌門呈顯著負相關(P<0.05)。

**.P<0.01;*.P<0.05;色帶相應顏色與熱圖矩陣數據相映射,靠近正值顏色(紅色)即為正相關,靠近負值顏色(藍色)即為負相關。The corresponding color of the color band is mapped to the heat map matrix data, and the color close to the positive value (red) is a positive correlation and the color close to the negative value (blue) is a negative correlation.

冗余分析(圖6)表明,第一、二排序軸分別解釋了土壤細菌群落結構變化的0.687%和37.640%。5個環境因子分布在3個象限中,其中pH落在第一象限,與落在第二、三象限的4種土壤環境因子(全氮、速效磷、速效鉀和有機質含量)呈負相關。9個牡丹野生種根際土壤微生物中放線菌門和綠彎菌門與pH因子呈正相關,與全氮、速效磷、速效鉀和有機質含量呈負相關;酸桿菌門和變形菌門與全氮、速效磷、速效鉀和有機質含量呈正相關,與pH呈負相關。9個牡丹野生種與環境因子的箭頭越近,表明其與該環境因子的正相關性越大,反之負相關性越大。四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤微生物與土壤有機質和全氮含量呈正相關;黃牡丹、楊山牡丹和大花黃牡丹的土壤根際微生物與土壤全氮、速效磷、速效鉀和有機質含量呈正相關;狹葉牡丹的土壤根際微生物與土壤速效鉀和速效磷含量呈正相關;紫牡丹的根際土壤微生物與土壤pH呈顯著正相關。

紅色箭頭表示環境因子,藍色箭頭表示門水平上根際土壤細菌(top 4),長短代表其在排序空間內的變化量,箭頭所處象限代表其與排序軸之間相關性的正負。The red arrows represent environmental factors, the blue arrows represent rhizosphere soil bacteria (top 4) at the phylum level, the length represents its variation in the sorting space, and the quadrants where the arrows are located represent the positive and negative correlations between them and the sorting axis. A. 四川牡丹P. decomposita; B. 紫斑牡丹P. rockii; C. 黃牡丹P. lutea; D. 卵葉牡丹P. qiui; E. 楊山牡丹P. ostii; F. 狹葉牡丹P. potanini; G. 紫牡丹P. delavayi; H. 稷山牡丹P. jishanensis; I. 大花黃牡丹P. ludlowii. 數字表示重復。The number represents repetition. pH. 酸堿度potential of hydrogen; SOM. 有機質soil organic matter; TN. 全氮total nitrogen; AP. 速效磷available phosphorous; AK. 速效鉀available K.Proteobacteria.變形菌門;Acidobacteria .酸桿菌門;Actinobacteria.放線菌門; Chloroflexi.綠彎菌門。

3 討 論

野生植物種質資源的保護及利用是育種工作者面臨的重要問題之一,不僅要收集和保護野生種質資源,還要通過不斷研究將其合理地利用到育種中[27]。根際土壤微生物群落作為根際微生物系統的重要組成部分,驅動著土壤系統中各種生物進程,能夠分解有機物,對植物生長發育起重要作用[28-29]。微生物在根際大量繁殖,構成一個旺盛的生物活動區,對植物生長發育具有很大影響,例如,加快有機質的分解、促進營養元素的轉化、刺激植物的生長、避免土傳病原菌的侵染等[30]。本研究采集了9個牡丹野生種根際土壤樣品,分析其理化特性,并利用分子生物學和高通量測序技術對根際土壤細菌群落多樣性進行研究。9個牡丹野生種分別于1992年、1998年和1999年引種到甘肅省農業技術推廣總站,經過長達20多年的統一管理和馴化,已適應引種地的生長環境[31],其土壤細菌群落特征因受到不同種牡丹根系的影響而產生差異,具有種間可比性。結果發現楊山牡丹根際土壤pH最高。孫曉剛等[32]在研究土壤pH對牡丹生長和光合特性影響時發現,不同pH的土壤對植株生長產生明顯的影響。然而在四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤中有機質含量最高,在黃牡丹、狹葉牡丹和稷山牡丹根際土壤中含量最少,土壤有機質具有提供植物生長的各種養分,增強土壤的保水保肥能力和緩沖性等作用。氮磷鉀含量在9個種牡丹中存在差異。此外,9個牡丹野生種根際細菌群落結構組成雖有一定的相似性,但也存在差異。9個野生種根際細菌數量最多的4個門分別為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門。這與李怡等[33]研究發現剛竹屬3個竹種根際土壤微生物土壤細菌群落相一致。Chen等[34]在高原淡水湖和上坡土壤細菌群落的研究中也得出相同的結果。對多種植物根際土壤細菌研究也發現上述菌門是優勢菌門,表明植物根際土壤微生物優勢菌門組成具有高度相似性[35-39]。已有牡丹相關根際微生物研究表明,變形菌門和放線菌門是不同品種牡丹根際細菌群落中共有的優勢菌門[17, 24]。除了這些具有促進生長發育的優勢菌門外,牡丹野生種根際中還具有較高豐度的酸桿菌門和綠彎菌門,推測這和牡丹野生種耐酸和耐熱的生長習性有關。

Alpha多樣性分析發現,楊山牡丹根際細菌群落數目最高。Beta分析結果表明稷山牡丹、紫牡丹和卵葉牡丹根際微生物群落結構與四川牡丹、紫斑牡丹、黃牡丹、楊山牡丹、狹葉牡丹和大花黃牡丹存在差異。上述結果表明不同牡丹野生種根際細菌群落的Alpha及Beta多樣性不同,且結構和豐富度是動態變化的。狹葉牡丹和四川牡丹產于四川西部,生長在海拔2 800～3 700 m的山坡灌叢中;稷山牡丹分布于陜西延安,生長在山坡疏林中;楊山牡丹為江南種,是中原牡丹品種群祖先之一。因此,推測根際菌群結構可能與其適宜生長環境有關。

差異分析發現,牡丹野生種根際細菌群落中的酸桿菌門和亞硝化螺菌屬(四川牡丹)、綠彎菌門(狹葉牡丹)、硝化螺旋菌門(大花黃牡丹)、假單胞菌屬(黃牡丹)及芽單胞菌門(楊山牡丹)等有益菌種在生態系統中扮演耐酸、耐熱、礦化有機物等重要角色[40-43],今后有望分離有益菌種應用于實踐,這些細菌在牡丹生長過程中與其他植物一樣發揮著重要作用?；赑ICRUSt2功能預測,發現不同樣本根際細菌群落的功能預測多集中在代謝、遺傳信息處理和環境信息處理相關通路上,表明野生種牡丹根際細菌在這些途徑和效應中發揮重要作用。土壤環境因子與根際土壤細菌群落的相關性分析結果表明,對牡丹野生種根際細菌群落影響較大的土壤環境因子主要是有機質和速效鉀。冗余分析結果表示,四川牡丹和紫斑牡丹根際土壤細菌受土壤有機質和全氮影響較大,黃牡丹、楊山牡丹和大花黃牡丹受土壤全氮、速效磷、速效鉀和有機質影響,對狹葉牡丹影響較大的是土壤速效鉀和速效磷,對紫牡丹影響較大的是土壤pH。

4 結 論

本研究分析了9個牡丹野生種在其引種地的根際土壤理化特性,并利用Miseq高通量測序技術探究了土壤細菌群落組成和物種豐度。土壤pH、有機質、全氮、速效磷和速效鉀含量在不同種牡丹根際存在顯著差異。野生種根際土壤細菌群落組成和物種豐度非常豐富,但不同種間存在顯著差異。變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門是主要優勢菌門,相對豐度之和可達79.9%。酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌門、亞硝化螺菌屬和假單胞菌屬等有益菌種在不同種間存在差異。根際細菌群落功能預測多集中在代謝、遺傳信息處理和環境信息處理方面。對牡丹野生種根際細菌群落影響較大的土壤環境因子為有機質和速效鉀。研究結果對有效利用微生物資源和保護野生植物種質資源具有重要的理論意義,為改良牡丹野生種的土壤環境、實現優質種質資源廣譜性種植奠定基礎。