花楸屬直脈組7種/變種基因組大小及葉表皮微形態特征的分類學意義

邱 靖,李嘉寶,朱大海,陳 昕

(1.南京林業大學,南方現代林業協同創新中心,南京林業大學生物與環境學院,江蘇 南京 210037;2.三江學院,江蘇 南京 210012;3.龍溪-虹口國家級自然保護區,四川 成都 611830)

花楸屬(Sorbus)隸屬于薔薇科蘋果亞科,主要分布于北半球的溫帶地區,我國是該屬的物種多樣性分布中心[1]。該屬通常分為6個亞屬:復葉的花楸亞屬(subg.Sorbus)和subg.Cormus;單葉的白花楸亞屬(Subg.Aria)、水榆亞屬(Subg.Micromeles)、Subg.Chamaemespilus和subg.Torminalis[2],或將水榆和Chamaemespilus亞屬并入白花楸亞屬而分為4個亞屬[3]。分子系統學研究多認為花楸屬為復系,支持將亞屬提升到屬的地位[4-6],但也有研究表明亞屬間界限不清晰,各自不能形成單系[7]。

不僅花楸屬的界定和屬下分類存在分歧,物種數量和種間親緣關系認知也存在顯著不同[3,8-9]。直脈組(SorbusSect.Alnifoliae)即是很好例證。直脈組是Aldasoro等[3]最新單葉花楸屬植物分類修訂中白花楸亞屬的7個組之一,包括水榆花楸[S.alnifolia(Sieb. et Zucc.)K. Koch]、石灰花楸[S.folgneri(C.K. Schneid.) Rehder]、日本花楸[S.japonica(Decne)Hedl]、神農架花楸(S.yuanaSpongberg)和長果花楸(S.zahlbruckneriC.K. Schneid.)5種。直脈組的界定同俞德浚等[10]的直脈系(Ser.AlnifoliaeT.T. Yu)差異很大。直脈系4種植物中僅水榆花楸1種被置于直脈組,且水榆花楸的兩個變種棱果花楸(S.alnifoliavar.angulataS. B. Liang)和裂葉水榆花楸(S.alnifoliavar.lobulataRehd.)均被作為日本花楸的異名處理。

基因組大小是指染色體基數x的DNA含量Cx值,或體細胞的DNA含量2C值。被子植物的基因組大小相差約2 400倍[11]?；蚪M大小差異不僅存在于不同物種之間,還存在于同一物種不同倍性的個體之間。同種植物的2C值有隨染色體倍性增加而成倍增加的趨勢[12],同屬植物的2C值亦有隨倍性加大而增加的趨勢[13]。因而,2C值作為物種的重要特征,不僅可為物種的分類界定和親緣關系理解提供依據,2C值與染色體計數相結合,還可準確判斷植物倍性?；ㄩ睂僦参锉缎詮碗s,基因組大小測定是該屬植物倍性判斷和系統演化理解的重要方法[14-17]。

葉表皮形態特征是植物本身遺傳特性表達,具有分類學研究價值[18-19]。葉表皮細胞大小同基因組大小之間還存在著一定的相關性。同一物種多倍體個體的細胞顯著大于它們的二倍體祖先[20],不同物種的基因組大小同表皮細胞和氣孔大小也呈現正相關[21]。葉表皮特征尤其是氣孔特征還同物種生態環境適應策略密切關聯[22]。因而,細胞大小、基因組大小、倍性特征及其相關性具有分類、生態適應和生活史對策上的研究價值[23]。

本研究采用流式細胞術對直脈組植物的基因組大小進行測定并推斷其倍性,利用光學和電子顯微鏡對葉表皮細胞和氣孔的定性和定量性狀進行分析,以期探討基因組大小和葉表皮特征的分類學意義以及基因組大小同倍性和細胞大小之間的相關性,同時為棱果花楸和裂葉水榆花楸的分類處理提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以花楸屬直脈組5種花楸:水榆花楸、石灰花楸、日本花楸、神農架花楸和長果花楸,以及具有分類爭議的2個變種裂葉水榆花楸和棱果花楸為研究對象。每居群選擇3個單株,單株間距50 m以上。采集上述花楸野生居群中成年單株的健康葉片,硅膠干燥,-80 ℃低溫保存備用;采集完整葉片壓干;憑證標本保存于南京林業大學標本館(NF),標本采集信息見表1。

表1 花楸屬直脈組植物采集信息

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組大小測定

以水稻品種日本晴(Oryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’; 2C=0.91 pg)為內標,取待測樣品1 cm2與等量內標共同置于1 mL預冷的WPB解離液[24]中,用鋒利的刀片快速切碎。用38 μm (400 目)的濾網過濾,獲得細胞核懸浮液。隨后向其中加入 50 μL 預冷的 PI 染液,置于 4 ℃冰箱避光染色 10 min。采用 BD Influx 流式細胞儀進行樣品檢測,低速收集 5 000～10 000 個顆粒。選用 488 nm 藍光激發 PI,于 FL2 通道收集 PI 發射的熒光強度;每個樣本做 3 次平行測定。

使用BD Influx自帶軟件FACSTMSortware1.0.0.650對圖像及檢測結果進行處理。樣本基因組大小的計算公式為:待測樣本基因組大小為待測樣本G0或G1峰熒光均值與對照樣本G0或G1峰熒光均值之比與對照樣本基因組大小之積。其中,G0為分裂停止期,G1為細胞DNA復制未開始期。變異系數(coefficient of variation, CV)控制在5%以內。

1.2.2 葉表皮微形態特征觀察測量

光學顯微鏡觀察。從每種/變種花楸中隨機選取成熟葉片2片,在盡量避開中脈及較大側脈的每一葉片中部切取面積5 mm × 5 mm的小塊2塊,加入沸水中煮40 min將其軟化。隨后將葉片轉移至冰醋酸與30%(體積分數)過氧化氫的等比混合液中,于60 ℃下水浴加熱14～16 h至葉片全白且有透明氣泡出現,便可將葉片取出,用鑷子輕輕分離上下表皮并除去殘留葉肉。將分離好的上下表皮置于1%(質量分數)番紅-50%(體積分數)酒精溶液中染色20 min,取出表皮放入蒸餾水中漂洗約20 min。最后用中性樹膠封片,于室內自然晾干。在Nikon Eclipse Ci-S(日本)光學顯微鏡的40倍物鏡下隨機選取每種植物的5個上表皮視野和10個下表皮視野進行觀察和拍照。從視野中隨機選取上、下表皮細胞及氣孔器各50個,用ImageJ 1.4.8軟件測量表皮細胞面積、氣孔器長、寬及氣孔面積。統計單位視野內氣孔數和表皮細胞數,計算氣孔密度(DS)和氣孔指數(IS)。計算公式如下:DS=S/N,IS=[S/E+S)]× 100%。式中:N為單位視野面積,S為單位視野面積上的氣孔數,E為相同面積內的表皮細胞數。

掃描電鏡觀察。先用毛筆輕輕拂去葉片表面灰塵,每種葉片切取 5 mm × 5 mm 的小塊,在 FEI-Quanta 200 掃描電子顯微鏡(美國)下對上、下表皮進行拍照、觀察及記錄。

氣孔器所用術語參考Dilcher[25]、王宇飛等[26];葉片角質膜及蠟質紋飾所用的術語參考Barthlott等[27]。

1.2.3 數據分析

所有數據用Excel進行統計處理,結果以“平均值±標準誤差”表示,利用SPSS 22.0對數據進行ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 基因組大小

由花楸屬直脈組7種/變種基因組流式直方圖見圖1。

P1.水稻‘日本晴’(Oryza sativa subsp. japonica‘Nipponbare’);P2.樣品材料sample。

由圖1可見,內標峰和樣品峰區分度良好,顯示了水稻日本晴作為內標測定的數據可靠性?；ㄩ睂僦泵}組植物2C值和Cx值分別介于1.348～1.586 pg和 0.674～0.793 pg(表2),長果花楸2C值最大且顯著高于其他類群,神農架花楸值最小且顯著低于其他類群。水榆花楸及其變種棱果花楸和裂葉水榆花楸2C值和1C值差異不顯著,三者顯著高于日本花楸。

表2 花楸屬直脈組植物的基因組大小及倍性水平

依據C值庫(https: //cvalues. science. kew. org/)中花楸屬植物不同倍性的2C值變化區間,推斷直脈組植物均為二倍體。

2.2 葉表皮微形態特征

2.2.1 葉表皮細胞微形態特征

直脈組花楸的葉表皮細胞兼具多邊形和不規則形或僅具不規則形。垂周壁隆起或凹陷,多邊形細胞的垂周壁有平直和弧形兩種樣式,不規則形細胞的垂周壁呈波狀。裂葉水榆花楸(圖2C)和長果花楸(圖2G)的上、下表皮均為不規則形,其他5個分類群則兼具多邊和不規則形。

1.上表皮adaxial epidermis; 2.下表皮abaxial epidermis。A.水榆花楸S. alnifolia;B.棱果花楸S. alnifolia var. angulata;C.裂葉水榆花楸S. alnifolia var. lobulata;D.石灰花楸S. folgneri;E.日本花楸S. japonica;F.神農架花楸S. yuana;G.長果花楸S. zahlbruckneri。下同。The same below.

垂周壁凹陷平周壁隆起的僅見于棱果花楸上下表皮(圖3B)和石灰花楸上表皮(圖3D),其他分類群均為垂周壁隆起,平周壁凹陷。

a、b.上表皮 adaxial epidermis (a. 800×;b. 3 000×);c、d、e.下表皮 abaxial epidermis (c. 200×,d. 800×;e. 3 000×)。

細胞表面紋飾有局部加厚、脊狀隆起、皺褶、網紋、光滑5種類型,局部加厚最為常見。葉表皮微形態部特征見表3。結合電鏡下葉表皮特征(圖3)可知,棱果花楸近光滑的上表皮(圖3B)、石灰花楸脊狀隆起的上表皮(圖3D)、日本花楸網紋狀的上表皮(圖3E)使三者易于同其他類群區分開來。表皮蠟質紋飾平滑層、殼狀、顆粒狀、片狀、線狀5種類型,平滑層見于水榆花楸(圖3A)和長果花楸(圖3G),其他分類群為殼狀;顆粒狀為共有紋飾(圖3);片狀、線狀則同時出現在水榆花楸(圖3A)、裂葉水榆花楸(圖3C)和長果花楸(圖3G)中,棱果花楸的下表皮(圖3B)和石灰花楸的上表皮(圖3D)具線狀紋飾。

表3 花楸屬直脈組植物葉表皮微形態特征(定性性狀)

分類群間的表皮細胞面積差異顯著。上表皮細胞面積介于605.05～967.63 μm2,下表皮細胞面積介于496.84～826.62 μm2(表4)。長果花楸的上、下表皮面積均最大且顯著大于其他分類群,神農架花楸的上表皮面積最小,下表皮面積大于石灰花楸但顯著小于另5個分類群。裂葉水榆花楸和日本花楸的上下表皮細胞均顯著大于水榆花楸和棱果花楸。

表4 花楸屬直脈組植物葉表皮細胞與氣孔數量微形態特征(定量性狀)

2.2.2 氣孔器微形態特征

花楸屬直脈組植物的氣孔器均分布在葉片下表皮脈間區,氣孔器都由兩個腎形保衛細胞組合而成,無副衛細胞,氣孔類型均為無規則型(圖2)。

氣孔器多呈橢圓形或圓形,氣孔器長度介于24.41～30.81 μm,分類群間無顯著差異。氣孔器寬度和面積分別介于19.58～22.87 μm和457.59～564.55 μm2,兩者在分類群間存在顯著差異(表4)。裂葉水榆花楸的氣孔器長、寬、面積3項指標均為最低,長果花楸氣孔最長,棱果花楸氣孔最寬且面積最大。

保衛細胞凸起或平,不凹陷。除裂葉水榆花楸(圖3C)而外,其他6個分類群均具有完全或不完全的環形外緣,其中水榆花楸(圖3A)、棱果花楸(圖3B)和石灰花楸(圖3D)氣孔兩極T狀加厚。氣孔紋飾有殼狀、顆粒狀、片狀或近光滑。

氣孔密度介于101.82～265.02 個/mm2,日本花楸最低,棱果花楸密度最大,后者是前者的2.01倍。氣孔指數為7.64%～17.08%,棱果花楸最高,日本花楸最低。

2.2.3 表皮毛

直脈組植物成熟葉片的表皮具毛或光滑。具毛的植物有石灰花楸(圖3D)、日本花楸(圖3E)、神農架花楸(圖3F)和長果花楸(圖3G)4種,且毛狀體均位于下表皮且呈帶狀。石灰花楸的毛被最密,覆被下表皮致使細胞形狀和紋飾均不可見。水榆花楸及其變種棱果花楸、裂葉水榆花楸葉表皮光滑(表3)。

2.3 相關性分析

基因組大小與葉表皮性狀之間、表皮性狀各特征之間的相關性分析結果如表5。由表5可見,基因組大小與上、下表皮細胞面積以及氣孔器長、寬、面積均呈正相關,而同氣孔密度和氣孔指數呈負相關?；蚪M大小與上表皮細胞面積呈顯著正相關(R=0.737,P<0.05),與氣孔器長度相關性位列第2(R=0.562)。表皮性狀各特征之間相關性最大的為氣孔密度和氣孔指數,其次為氣孔長寬和氣孔面積,均呈極顯著相關(P<0.01);上下表皮細胞面積之間呈顯著正相關,而上下表皮細胞面積與氣孔密度之間也均呈顯著負相關(P<0.05)。

表5 花楸屬直脈組植物的基因組大小與葉表皮性狀的相關系數

3 討 論

花楸屬直脈組植物Cx值為0.674～0.793 pg,同薔薇科其他屬一樣[28],均屬于極小基因組(Cx≤1.4 pg)?；诹魇郊毎g(FCM)倍性推斷的可靠性因類群而異,如同屬蘋果亞科(Maloideae),2C值在唐棣屬(Amelanchier)的不同倍性之間分化良好[29],在山楂屬(Crataegus)不同倍性之間則存在重疊區域[30]?；ㄩ睂僦参锊煌缎缘?C值區分良好,不存在重疊區域,基于FCM基因組大小測定的倍性推斷可靠性高[16-17]。本實驗直脈組植物均為二倍體,2C值的最高值在前期報道范圍內,而最低值為1.348,較前期報道略低;水榆花楸而外的6個分類群基因組大小為首次報道[27]。原產歐洲的白花楸亞屬植物有2x、3x、4x、5x4種倍性水平,多倍體和無融合生殖類群數量眾多[31],該亞屬在亞洲尚無多倍體報道,亞洲是否存在多倍體還需進一步的實驗研究。

葉表皮特征在薔薇科具有重要的分類價值[32-33]。直脈組植物葉表皮具有一定的共同特征,如均具有等徑或伸長的細胞、氣孔均分布于下表皮且均為無規則形等,但其表皮紋飾、蠟質類型、氣孔特征等同蘋果亞科的蘋果屬(Malus)[34]、山楂屬[13]、乃至花楸屬復葉組[35]差異較大。直脈組的葉表皮綜合特征可以為組內物種鑒定提供有價值的依據,通過細胞形狀可以將該組分為兩類,僅具有不規則形細胞的裂葉水榆花楸和長果花楸,兩種可以通過氣孔是否具有環形外緣進一步區分開來,兼具多邊形和不規則形的5個分類群可以通過毛被有無及疏密、垂周壁凹陷或隆起、表皮紋飾等進行區分。爭議分類群裂葉水榆花楸的上、下表皮均為不規則形、棱果花楸的垂周壁凹陷平周壁隆起,加之兩者的表皮細胞和氣孔的大小和紋飾,可以將兩者同水榆花楸和日本花楸明確區分;日本花楸網紋狀紋飾使之顯著區別于其他6個分類群。因而本研究不支持Aldasoro等[3]將棱果花楸和裂葉水榆花楸作為日本花楸異名的分類處理。

基因組大小和細胞大小的相關性在植物界普遍存在,本研究也為這種相關性提供了佐證?；蚪M大小對細胞大小,尤其是氣孔大小和密度的影響,進而可能影響植物的生理活動,在生態適應和生活史對策上起做重要的作用[21];與此同時,氣孔也會在一定程度上通過響應環境變化而推動基因組大小進化[22]。本研究中各個種的采集地和海拔有很大差異,其基因組大小與細胞特征是否會隨環境變化而呈現不同的適應響應還需要更多居群的研究證據。