白蠟花粉最佳離體萌發培養基篩選

劉 蓉,吳德軍,王因花,任 飛,李 麗,燕麗萍,周曉鋒

(1.山東省林業科學研究院,山東省林木遺傳改良重點實驗室,山東 濟南 250014;2.中國農業大學煙臺研究院,山東 煙臺 264670)

白蠟屬(Fraxinus)植物具有耐寒、耐旱、耐澇、耐鹽堿,對土壤要求不嚴,生長速度快、樹齡長、生長繁殖比較容易、適應性較強、樹木材質好等優點,被廣泛應用于防護林和城市綠化中[1],是重要的園林綠化樹種。白蠟屬植物雌雄異株,風媒傳粉,混栽時極易天然授粉雜交[2],種子變異性大,影響景觀效果。雜交育種可以對白蠟(Fraxinuschinensis)的優良性狀進行有目的的雜交組合,并且不需要繁雜的去雄等工作,因此可作為培育白蠟優良樹種的重要手段之一?；ǚ刍盍Φ难芯繉χ参锖罄m的授粉受精具有重要的意義。白蠟單花花粉產量不高,適用于花枝采集法采集花粉,將花枝剪下后水培,花朵自然散粉后再進行收集[3]。收集后的花粉需要進行活力檢測,通常分為萌發測定和非萌發測定[4];與后者相比,前者簡單快速、應用范圍廣、結果更可靠[5],分固體培養基法和液體培養基法兩種。體外花粉萌發和花粉管生長的研究是鑒定環境因素和基因型差異對花粉活力的影響的有效方式[6]。不同的植物適用的方法不同,如百合 (Lilium)花粉表面有一層油狀物質,使用固體培養基法難以操作且培養時間長,因此劉向東等[7]選擇了采用固體培養基法測定花粉活力,而屈海泳等[8]在檢測桃(Prunuspersica)花粉活性試驗中發現,桃花花粉活力不適宜采用液體培養基法測定。采用花粉離體測定法最重要的是培養基的成分以及培養的適宜條件,研究表明蔗糖可以為花粉的萌發提供碳源,硼酸可以促進蔗糖的吸收和代謝,在一定濃度范圍內可以促進花粉萌發和花粉管生長;鈣離子調控花粉管的生長[9],外部施加鈣離子含量的高低取決于花粉自身鈣離子的含量,過多會抑制花粉管的生長[10],在適宜的培養基上,能夠準確地分析花粉萌發及花粉管生長情況[11]。2007年,宛文鵬[12]通過研究初步得到了比較適宜水曲柳(Fraxinusmandshurica)花粉萌發的培養基,李淑娟[13]在此基礎上,采用基于BBD的響應面法優化了水曲柳花粉離體萌發的培養基,但并沒有深入探討不同培養基中花粉萌發率及花粉管伸長的情況。Kremer等[14]研究了不同培養溫度下美國紅梣(Fraxinuspennsylvanica)的變種‘Marshall’的花粉萌發率和花粉管生長狀況,得出適宜的溫度應該是高于20 ℃,但萌發率不高,均低于20%。然而,目前對于白蠟屬其他種的花粉離體萌發培養條件以及不同物理狀態的培養基下白蠟花粉的萌發情況鮮有研究。

美國紅梣‘魯蠟5號’(Fraxinuspennsylvanica‘Lula 5’)為白蠟雄株,是山東省林業科學研究院(山東林科院)從山東省栽培的紅梣中選育出的優良無性系,具有普通白蠟的一切優點,同時在生長速度、出苗周期及觀賞價值方面是普通白蠟的2～3倍[15];絨毛白蠟‘金箭’(F.velutina‘Jinjian’)為白蠟雄株,是由山東林科院從收集的絨毛白蠟種質資源中選育的白蠟新品種,具有速生、樹形優美、耐鹽堿性強等觀賞價值和經濟價值高的優良特性,二者均具備特異性、一致性和穩定性,樹干通直挺拔,分枝角度小,生長量大,是速生白蠟的優化樹種,可用作城市園林綠化和荒山造林。為此,本研究采用絨毛白蠟‘金箭’和美國紅梣‘魯蠟5號’的花粉進行離體萌發測定,研究其適宜的培養條件,旨在為白蠟的雜交育種提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于山東省濟南市山東林科院苗圃中試基地(117.094 27°E,36.726 22°N),海拔26 m,年均氣溫在 14.3 ℃左右,無霜期 178 d;年均降水量 665.7 mm,降雨多集中在 6—8 月,占全年降雨量的 65%以上。

1.2 試驗材料

2020年 3 月選取生長健壯、發育良好的絨毛白蠟‘金箭’和美國紅梣‘魯蠟5號’做采粉樹,于開花前 1～2 d,選取花質均一、花期一致的花蕾套袋并掛牌標記,防止花粉污染。在雄樹盛花期前,將花枝剪下,室內20～25 ℃下水培,散粉后收集花粉,從8:00—16:00每2 h隨機采集2～5個花枝的花粉,連續3 d對同一花枝采集花粉,直至花朵萎蔫,分別收集花粉放入離心管中,貼上標簽備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 固體和液體培養基法測定花粉活力

將花粉均勻撒布在固體培養基(瓊脂質量濃度為5 g/L)和液體培養基上,將培養皿置于25 ℃的恒溫培養箱中,培養2.5 h后觀察花粉萌發情況,統計萌發率,培養基配方見表1。

表1 培養基配方表

觀察時突出的花粉管長度大于寬度即視為萌發,取3個視野的平均值作為該培養皿的花粉萌發率及花粉管長度,每個視野花粉數不少于100粒,每個樣品設置3次重復?；ǚ勖劝l率為已萌發的花粉數占花粉總數之百分比。

1.3.2 花粉離體培養時間和花粉管長度測量

采用固體培養基法進行離體培養,培養基成分為蔗糖 150 g/L+ 硼酸 20 mg/L+ 氯化鈣 30 mg/L,在 25 ℃ 條件下,在恒溫培養箱中分別培養 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h 后檢測花粉萌發及花粉管生長情況,每個視野花粉數不少于100粒,重復 3 次。隨機選擇20個花粉管,用顯微鏡觀測(操作軟件中自帶標尺)測量花粉管長度。

1.3.3 3因素3水平L9(34)正交試驗設計

分別將3種濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣按照正交試驗設計法添加于瓊脂粉濃度為5 g/L的固體培養基中,測定白蠟花粉活力,因素及水平見表2。

表2 正交試驗設計因素和水平

1.4 數據統計及處理

試驗數據均用Excel 2010進行處理,繪制圖表,用IBM SPSS Statistics 21進行差異顯著性分析及Duncan多重比較,數據用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 固體與液體培養基法測定花粉活力對比

試驗采用固體培養基和液體培養基分別測定‘金箭’‘魯蠟5號’花粉的萌發情況見圖1。由圖1可知,從培養基類型來說,‘金箭’和‘魯蠟5號’的花粉均在02號固體培養基上萌發率最高,固體培養基上‘金箭’的花粉萌發率均顯著高于液體培養基,02和03號固體培養基上的‘魯蠟5號’的花粉萌發率顯著高于液體培養基,01和04號固液培養基無顯著差異。從品種來說,01號固體培養基上的 ‘魯蠟5號’的花粉萌發率比‘金箭’高16.03百分點,02、03、04號固體培養基上的‘金箭’和‘魯蠟5號’的花粉萌發率均比較小,01、02、03、04號液體培養基上的 ‘魯蠟5號’的花粉萌發率分別比‘金箭’高25.63、11.42、15.66、19.53百分點。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same below.

‘金箭’和‘魯蠟5號’花粉的萌發情況見圖2、圖3。

A.固體培養基solid medium;B.液體培養基liquid medium。數字為培養基編號Number is medium No.。下同。The same below.

圖3 固體培養基法與液體培養基法測定‘魯蠟5號’花粉活力Fig.3 Pollen vitality of ‘Lula 5’ was on solid and liquid medium

由圖2、圖3可知,固體培養基上較難均勻散播花粉,花粉易堆積,影響后續觀察,但花粉萌發率比液體培養基高;液體培養基上的花粉分布均勻,易于統計觀察,但花粉萌發率較低。綜上,‘金箭’‘魯蠟5號’的花粉萌發率均為固體培養基優于液體培養基,花粉萌發率以02號培養基最高,其中‘金箭’在02號固體培養基上的花粉萌發率比液體培養基的高21.86%,‘魯蠟5號’在02號固體培養基上的花粉萌發率比液體培養基的高12.15%,測定白蠟花粉活力仍是固體培養基更佳。

2.2 花粉離體培養時間和花粉管長度測量

通過對白蠟花粉的萌發以及花粉管的生長情況(圖4、圖5)觀察可以看出,‘金箭’和‘魯蠟5號’花粉的萌發率隨培養時間的變化趨勢相同,均為快速上升后趨于穩定,其中‘金箭’的花粉萌發率在0.5～1.5 h和1.5～2.5 h內均顯著上升,隨后保持穩定;‘魯蠟5號’的花粉萌發率在0.5～1.5 h內顯著上升后保持穩定,可知‘魯蠟5號’花粉萌發的速度比‘金箭’快?！鸺汀斚?號’的花粉管長度在0.5～5.5 h內持續增加,‘金箭’在0.5～1.5 h和1.5～2.5 h內增加幅度較大,‘魯蠟5號’在0.5～1.5 h內增加幅度較大,‘魯蠟5號’初期增長的速度高于‘金箭’,但隨著培養時間的延長,‘金箭’的花粉管長度逐漸大于‘魯蠟5號’。綜上,培養2.5 h左右的花粉適宜進行花粉生活力的觀察和計數;1.5 h后的花粉管長且彎曲,不利于測量統計,因此試驗選擇在0.5 h時觀察并測量花粉管長度。

圖4 離體培養時間對‘金箭’和‘魯蠟5號’花粉萌發及花粉管伸長的影響Fig.4 Effects of germination time in vitro on pollen germination and pollen tube length of Jinjian’ and ‘Lula 5’

圖5 ‘金箭’和‘魯蠟5號’花粉的萌發及花粉管生長隨培養時間的變化情況Fig.5 Changes of pollen germination and pollen tube growth with germination time of ‘Jinjian’ and ‘Lula 5’

2.3 花粉活力測定3因素正交試驗

將培養基成分蔗糖、硼酸及氯化鈣3個影響白蠟花粉萌發特性的因素,按照L9(34)正交設計進行試驗,結果見表3—表6。

表3 正交L9(34)試驗對 ‘金箭’花粉萌發率及花粉管長度的影響

表4 3個因素的不同水平對‘金箭’花粉生長情況的影響

表5 正交L9(34)試驗對‘魯蠟5號’花粉萌發率及花粉管長度的影響

表6 3個因素的不同水平對‘魯蠟5號’花粉生長情況的影響

由表3可知,對于‘金箭’來說,4號培養基的萌發率最高,為60.86%,顯著高于除6號和9號以外的其余培養基;2號的萌發率最低,僅有11.29%,顯著低于除1號、3號外的其余培養基。從花粉管長度來看,4號培養基的長度為197.49 μm,顯著高于其余培養基, 8號的長度最短,為95.66 μm。由表4可知,不同濃度的蔗糖對‘金箭’花粉萌發率的影響顯著,最佳的濃度為150 g/L,其次是200 g/L,二者之間差異不顯著;而不同濃度的硼酸和氯化鈣對花粉離體萌發率影響較小,硼酸的最優濃度為20 mg/L,氯化鈣的最優濃度為30 mg/L;不同水平的蔗糖、硼酸、氯化鈣對花粉管生長的影響均不顯著。對表中數據進行方差分析(表4),由Ⅲ型平方和比較可知,對‘金箭’花粉萌發率的影響從大到小依次為:蔗糖>硼酸>氯化鈣,最優水平組合為A2B1C2,即150 g/L蔗糖+ 20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣;其次是A3B3C2。對‘金箭’花粉管伸長的影響氯化鈣>蔗糖>硼酸,最優水平組合為A2B1C2,即150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣,由此推論3個因子最佳組合為4號培養基150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣。

對于‘魯蠟5號’來說,4號培養基的萌發率最高,為69.12%,顯著高于除9號外的其余培養基;8號的萌發率最低,為21.6%,顯著低于除2號外的其余培養基。從花粉管長度來看,4號培養基的長度最長為221.25 μm,顯著高于2號、5號、7號、8號,與其余培養基無顯著差異;8號的長度最短為118.88 μm,顯著低于4號培養基。綜合來看,4號培養基的花粉生長情況最佳,其次為9號,8號的花粉生長情況最差。由表6可知,不同濃度的硼酸對‘魯蠟5號’花粉萌發率的影響顯著,最佳的濃度為40 mg/L,其次是20 mg/L,二者之間差異不顯著。而不同濃度的蔗糖和氯化鈣對花粉離體萌發率影響較小,蔗糖的最優濃度為150 g/L,氯化鈣的最優濃度為30 mg/L。不同水平的蔗糖、硼酸、氯化鈣對花粉管生長的影響均不顯著。由Ⅲ型平方和比較可得,對‘魯蠟5號’花粉萌發率的影響從大到小依次為:硼酸>蔗糖>氯化鈣,最優水平組合為A2B3C2,即蔗糖150 g/L、硼酸40 mg/L、氯化鈣30 mg/L。對花粉管伸長的影響蔗糖>氯化鈣>硼酸,最優水平組合為A2B1C2,與組合A2B3C2之間差異不顯著。因此,就‘魯蠟5號’花粉萌發而言,3個因素的最優組合是A2B3C2,即150 g/L蔗糖+40 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣,其次是4號培養基150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣。

3 討 論

1)培養基不同的物理狀態對花粉的生長與萌發有影響,試驗結果得出白蠟花粉在固體培養基上的萌發和生長均優于液體培養基,與屈海泳等[8]對桃(Prunuspersica)花粉萌發得出的結論一致,出現這種現象的原因可能有兩方面,一是由于花粉萌發需要一定的空氣,液體培養基完全使花粉與外界隔離,花粉得不到充足的空氣影響其發育,導致花粉萌發率降低;二是花粉的密度不合適,屈海泳等[8]表示培養基中花粉密度越大萌發率越低,而武沖等[16]的研究發現液體培養基培養花粉時密度至少要達到10 000粒/mL,兩種截然不同的結論還有待后續進行研究分析。前人研究表明,采用適宜配方的液體培養基測定茅蒼術(Atractylodeslancea)花粉活力,萌發率能夠達到62.1%[17];林開勤等[10]使用液體培養基法測定浙江紅山茶(Camelliachekiangoleosa)花粉的活力高達88.36%,說明對于部分植物,使用液體培養基法測定花粉活力是可行的,并且本試驗中使用02號液體培養基測定‘魯蠟5號’的花粉萌發率也達到了39.6%,顯著高于液體培養基的其他處理。因此綜合來看,液體培養法具有方便、快捷、易操作,花粉分布比較均勻,便于統計計算[18]等優點,但很多試驗表明,液體培養基中花粉的萌發率較低,且培養時間過長可能會出現花粉管破裂的現象[19],僅適合部分植物,而固體培養基法更適宜大部分植物的花粉進行萌發,花粉散布不均勻、易堆積等問題可以通過改進實驗操作方法來解決,比解決液體培養基法存在的問題更容易。

2)花粉能否正常萌發和花粉管能否正常伸長直接影響植物的受精作用?！鸺汀斚?號’的花粉在0.5 h后均出現萌發跡象且花粉管長度相近,在培養時間內,花粉管長度隨著培養時間的延長在不斷增加,2.5 h后萌發率均能達到最高,且花粉管生長速度也趨于平緩,萌發速度比遼寧楊(Populus×liaoningensis)、日本海棠(Malus×floribunda)和大葉相思(Acaciaauriculiformis)等花粉快[20-22],比鐘花櫻(Prunuscampanulata)稍慢[23],萌發速度相較于其他樹種偏快。相關性分析表明‘金箭’的花粉萌發率與花粉管長度存在顯著正相關,而‘魯蠟5號’的花粉萌發率和花粉管長度無相關關系,研究時應區別對待。

3)目前許多研究表明,在離體培養條件下,適宜濃度的蔗糖、硼和鈣能有效提高花粉的萌發率,對花粉管的伸長具有明顯的促進作用[24]。本試驗表明3個影響因素中蔗糖對‘金箭’花粉萌發有顯著影響,與李淑娟[13]得出的蔗糖對絨毛白蠟花粉萌發至關重要的結論一致,對‘魯蠟5號’花粉萌發有顯著影響的是硼酸,氯化鈣均無顯著影響,與Luo等[25]的研究一致。適合白蠟最優的花粉離體培養最優蔗糖濃度為150 g/L,高于或低于此濃度萌發率均會有所降低,與茶樹[10]、浙江紅山茶[10]、桂櫻(Prunuslaurocerasus)[26]等所需的蔗糖濃度一致,說明150 g/L的蔗糖濃度對于大多數種類植物的花粉離體萌發較為合適。適宜‘金箭’和‘魯蠟5號’花粉萌發的硼酸濃度略有差異,但濃度為20和40 mg/L時二者均有較高的萌發率,適宜白蠟花粉萌發的氯化鈣濃度為30 mg/L,高于或低于此濃度均會抑制花粉的萌發。李淑娟[13]等研究發現適宜絨毛白蠟花粉離體萌發的培養基為150 g/L蔗糖+40 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣,本研究表明適宜白蠟花粉萌發的蔗糖濃度為150 g/L,硼酸濃度為20 mg/L或40 mg/L,氯化鈣濃度為30 mg/L,試驗結果相近。

4 結 論

相比于液體培養基法,白蠟屬植物更適合采用固體培養基法測定其花粉活力,但如果能解決花粉在液體培養基中的透氣性問題,以及探索出適宜的花粉密度,那么液體培養基法一定是更加簡單快速測定白蠟花粉活力的方法。觀察白蠟花粉生長情況時發現,白蠟花粉的最適離體培養基為4號150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化鈣,花粉的萌發速度較快,0.5～1.5 h的培養時間為快速萌發階段,培養2.5 h后即可以統計花粉的萌發情況,但白蠟屬不同種的花粉萌發率與花粉管長度的相關性有差異。