產前應激對子代大鼠心臟代謝物輪廓變化的影響

張 力,孫宏利,高艷娥,蔡東閣

(1.西安交通大學第二附屬醫院婦產科,陜西西安 710004;2.西安市兒童醫院,陜西省兒科疾病研究所,陜西西安 710003)

產前環境對機體的發育有深遠的影響,懷孕期間的應激事件,即產前應激(prenatal stress,PS),會給后代帶來長期的生理和行為的改變[1-2]。流行病學證據表明,宮內生長受限與子代出生體質量和成年時期的心血管疾病之間密切相關[3]。目前,臨床根據心率變異性和唾液皮質醇來檢測孕婦的壓力水平得到良好的實驗室證據支持[4]。本課題組前期實驗結果表明,暴露于PS后的子代大鼠在強迫游泳實驗中不動時間顯著增加,在曠場實驗中穿越總格數顯著減少,在糖水偏好實驗中糖水消耗量顯著減少,這些實驗結果表明PS 可導致子代大鼠抑郁樣行為的發生[5]。PS可通過改變胎兒糖皮質激素水平降低神經系統的發育,從而控制胎兒心率[6]。大量臨床實驗結果表明,心血管疾病患者常伴隨著心理壓力,嚴重者可導致抑郁癥的發生[7-10]。由此可見,PS對心臟發育有著明顯的不利影響,然而,其潛在的生物學機制有待進一步探討。

代謝組學誕生于上個世紀末,由英國倫敦帝國大學JEREMY NICHOLSON 教授提出[11],主要研究生命體對外界刺激、病理生理變化以及本身基因突變而引起的分子質量小于1 500 Da以內的代謝產物(內源性代謝物)種類、數量及其變化規律的科學。小分子在人體內的作用一直被忽視。近年來,隨著代謝組學的發展,為探索這些小分子的變化提供了便利。特別是UHPLC-Q-TOF/MS方法,該方法在代謝組學研究中得到了廣泛的應用,其特點是用1.7μm 超細粒徑填料填充色譜柱,其速度至少比傳統HPLC分析快1倍,靈敏度和分離度是傳統HPLC分析的數倍并能提供中心碳循環代謝的最大信息。通過代謝組技術分析實驗組與對照組的代謝水平差異,找出差異代謝物,有助于生物標志物的篩選,或研究差異代謝物參與的生物過程(通過代謝通路逆推找出調節酶和基因),揭示其參與的生命活動的機制,完成調控通路等方面的研究。目前,代謝組學分析法廣泛應用于心血管疾病、胃腸道疾病和肝臟疾病等[12-14]。

本研究基于高分辨非靶向代謝組學分析PS 對子代大鼠心臟的代謝物輪廓的變化,并通過KEGG通路富集與對照組進行比對,篩選出關鍵信號通路和關鍵分子,探討其在暴露于PS后子代大鼠心臟發育中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用Sprague-Dawley大鼠共12只,購于西安交通大學醫學部實驗動物中心,體質量230～300 g,置于溫度為18～25℃,濕度45%～65%,暗/光環境12 h/12 h飼養1周,整個實驗過程大鼠可自由飲食、飲水。1周后將雌性和雄性大鼠按3∶1的比例于晚上20:00-22:00期間混合飼養,并在次日早上7:00-8:00對雌性大鼠進行陰道涂片檢查,檢出精子呈陽性,則將母鼠單籠飼養并記錄為妊娠第0天。所有妊娠大鼠隨機分組為產前應激(PS)組(妊娠14 d～20 d期間,孕鼠每天8:00-19:00給予3次束縛應激,相鄰兩次應激時間間隔不少于2 h,每次應激時長為45 min[15])和對照(CON)組(孕期不給予任何處理)。分娩后,待子鼠1月齡時,對照組和實驗組分別選取6只雄性子代大鼠進行實驗(每窩隨機挑選1～2只子鼠)。動物實驗經西安市兒童醫院動物倫理委員會審批(審批號:國2017001)。

1.2 UHPLC-Q-TOF/MS分析

用戊巴比妥鈉(60 mg/kg,腹腔注射)麻醉動物。在冰上立即取出大鼠心臟組織。用PBS沖洗心臟組織(60 mg),與800μL 冷甲醇/乙腈(1∶1,V/V)混合以去除蛋白質?；旌衔镌?℃下超聲30 min兩次,在-20℃下靜置1 h,離心15 min(13 000×g,4℃)。將上清液真空干燥,加入100μL 乙腈/水(1∶1,V/V)復溶,然后離心15 min(14 000×g,4℃)。取出上清液用于UHPLC-Q-TOF/MS分析。使用安捷倫1290 Infinity液相色譜系統(Agilent Technologies,Santa-Clara,California,USA)與安捷倫6550(Agilent Technologies,Santa-Clara,California,USA)和AB SCIEX 三重TOF 6600系統(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)進行聯合分析。在UHPLC-QTOF/MS檢測過程中,通過從每個樣品中獲取5 mg來制備質量控制(QC)樣品,并在樣品注入前用于測試儀器狀態和平衡色譜-質譜系統,以及用于評估整個實驗過程中的系統穩定性。

色譜分離使用2.1 mm×100 mm ACQUIY UHPLC BEH 1.7 m 色譜柱(waters,Ireland)在ESI正負模式下分析樣品,柱溫設置為25℃,流速為0.3 m L/min,進樣體積為2μL。流動相的組成如下:A=25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L 氫氧化銨水溶液,B=乙腈。梯度在0.5 min內為95%B,在7 min時線性降低到65%,然后在8 min 時降低到40%并保持1 min,然后在0.1 min內增加到95%,使用3 min的再平衡時間。

UHPLC分離后,從Agilent 6550獲得了ESI正負模式下的質譜信息。ESI源條件設置如下:氣體Tem 250℃,干燥氣體16 L/min,霧化器20 psig,鞘氣Tem 400℃,鞘氣流量12 L/min,vcap 3000 V,噴嘴電壓0 V。碎片175 V,質量范圍50～1 200,采集速率4 Hz,循環時間250 ms。在測試樣品后,通過AB Triple TOF 6600在質譜和MS/MS譜的ESI陽性和陰性模式下進行代謝物的鑒定。ESI源條件設置如下:離子源gas1(Gas1)40,離子源gas2(Gas2)80,幕簾氣體(CUR)30,源溫度650℃,離子分離電壓浮動(ISVF)5 000 V。MS/MS譜通過信息相關采集(IDA)在高靈敏度模式下采集,去簇電位(DP)60 V,碰撞能量(35±15)ev。IDA 設置如下:排除4 Da內的同位素,每個周期監測的候選離子10。為了擴大MS/MS譜圖的采集速率,數據采集按質量范圍分為4 段(50～300,290～600,590～900,890～1 200),每種方法每段采集4個重復。采用自建庫Met-DDA 和LipDDA(Shanghai Applied Protein Technology Co.,Ltd.)方法對代謝物結構進行鑒定。

1.3 生物信息學分析

使用XCMS 程序ProteoWizard MSConvert將原始UPLC-Q-TOF/MS數據轉換成mzXML 格式,用于特征檢測、保留時間校正和比對。Minfrac被設置為0.5。代謝物通過與實驗室數據庫匹配的精確質量數(m/z tolerance±30 ppm,RT tolerance±60 s)和MS/MS 數據進行鑒定。在使用SVR 和Peratoscaling方法進行歸一化和整合之后,將處理后的數據導入SIMCA-P 14.1(Umetrics,Umea,Sweden)進行多變量統計分析,包括主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)以及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。進行典型的7重交叉驗證和200 次迭代排列測試來驗證PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 模型?；贠PLS-DA 模型和對原始數據進行Two-tailedttest獲得VIP值和P值的統計確定顯著差異的代謝物,VIP 值大于1.0且P值小于0.05的代謝物被認為是顯著的。鑒定的差異代謝物隨后被上傳到KEGG 數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)進行信號通路和主導網絡分析。

2 結 果

2.1 UHPLC-Q-TOF/MS分析的質量控制

MCC是一種基于所有X 變量組合的多變量控制圖,可以顯示隨時間測量的數據,并監控實驗過程中的變化。MCC中的每個點代表一個QC樣本。一般在正負3個標準差范圍內都是合理的(圖1A)。皮爾遜相關分析的結果顯示QC 樣本具有良好的相關性(相關指數＞0.9,圖1B)。T2分析檢測是否存在異常樣本,如圖1C 所示,所有樣本都在99%的置信區間內。圖1D 將實驗樣本和QC 樣本提取得到的峰進行PCA 分析,結果表明QC 樣本緊密聚集在一起,說明實驗的重復性好。所有這些結果證明,UHPLC-Q-TOF/MS分析的質量控制是嚴格的,所有數據是客觀可靠的,適用于后續進一步的分析。

圖1 UHPLC-Q-TOF/MS分析的質量控制Fig.1 Quality control of UHPLC-Q-TOF/MS analysis

2.2 基于UHPLC-Q-TOF/MS的心臟組織代謝譜分析

PS組和CON 組大鼠心臟樣品的UHPLC-QTOF/MS代謝組學圖譜在正負離子模式合并后鑒定1 602種代謝物,其中正負離子模式下分別產生總共779和823 個離子峰。PCA 得分圖顯示了PS 組和CON 組之間無統計學差異(R2X=0.517,圖2A),PLS-DA 評分圖顯示了PS組和CON 組之間沒有統計學差異(R2X=0.442,R2Y=0.949,Q2=0.601,圖2B)。進一步采用OPLS-DA 模式分析,結果顯示兩組間有統計學差異(R2X=0.442,R2Y=0.949,Q2=0.004 86,圖2C)。圖2D 是OPLS-DA 模型置換 檢驗圖,隨著置換保留度逐漸降低,隨機模型的R2和Q2(R2=0.816 9,Q2=-0.231 2)均逐漸下降,說明原模型不存在過擬合現象,模型穩健性良好。

圖2 PS組和CON 組大鼠心臟組織的代謝組學分析Fig.2 Metabolomic analysis of heart tissue in PS and CON groups

2.3 PS組和CON組大鼠心臟組織代謝差異物的分析

以OPLS-DA VIP＞1和P＜0.05 為顯著性差異代謝物篩選標準,在兩組心臟組織中共鑒定出19種差異代謝物。19種代謝物的豐度在PS組大鼠和CON組中是不同的,用層次聚類熱圖分析顯示(圖3)。聚在同一簇內的代謝物具有相似的表達模式,可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或者細胞通路。

圖3 PS組和CON 組大鼠顯著性差異代謝物層次聚類熱圖Fig.3 Significant differences in metabolite hierarchical clustering heat map between rats in PS and CON groups

2.4 基于KEGG 的差異代謝物的生物信息學分析

PS組和CON 組大鼠之間顯著性差異代謝物(VIP＞1,P＜0.05)的KEGG 通路注釋結果如圖4所示。前10個顯著變化的信號通路分別是氨基酸的生物合成、嘌呤代謝、嘧啶代謝、丙氨酸/天冬氨酸鹽和谷氨酸代謝、c AMP信號通路、精氨酸的生物合成、GABA 能突觸、谷氨酸能突觸、尼古丁成癮和肌動蛋白細胞骨架調節。其中富集在嘌呤代謝、嘧啶代謝和精氨酸的生物合成通路中的L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、胞氨酸3＇-單磷酸、胞氨酸5＇-單磷酸、尿酸、2＇-脫氧腺苷5＇-單磷酸、黃嘌呤、精氨琥珀酸顯示出更為顯著的統計學差異。

圖4 KEGG 富集通路圖Fig.4 Diagram of KEGG enrichment pathway

3 討 論

研究報道慢性束縛應激可誘導心臟重塑和心律失常,可能是通過改變與DCM 和ASPC通路相關的心肌基因的甲基化[16]。本實驗采用產前束縛應激模型,研究PS 對子代大鼠心臟代謝物輪廓變化的影響。結果顯示,與對照組相比,PS組子代大鼠心臟組織中顯著變化的信號通路包括氨基酸的生物合成、嘌呤代謝、嘧啶代謝、丙氨酸/天冬氨酸鹽和谷氨酸代謝、c AMP 信號通路、精氨酸的生物合成、GABA 能突觸、谷氨酸能突觸、尼古丁成癮和肌動蛋白細胞骨架調節。其中富集在嘌呤代謝、嘧啶代謝和精氨酸的生物合成通路中的L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、胞氨酸3＇-單磷酸、胞氨酸5＇-單磷酸、尿酸、2＇-脫氧腺苷5＇-單磷酸、黃嘌呤、精氨琥珀酸可能是主要參與PS影響子代大鼠心臟發育的生物分子。

L-谷氨酰胺在心血管生理和病理中起著重要作用[17]。作為DNA、ATP、蛋白質和脂類合成的底物,L-谷氨酰胺驅動著血管細胞的關鍵過程,包括增殖、遷移、凋亡、衰老和細胞外基質沉積。此外,L-谷氨酰胺可通過誘導血紅素氧合酶-1、熱休克蛋白和谷胱甘肽的表達,在循環中發揮強大的抗氧化和抗炎作用。L-谷氨酰胺還可以作為l-精氨酸前體優化一氧化氮合成,從而促進心血管健康。更為重要的是,L-谷氨酰胺可減輕心血管疾病的許多危險因素,如高血壓、高脂血癥、葡萄糖不耐受、肥胖和糖尿病。許多研究表明,補充L-谷氨酰胺可預防心臟代謝疾病、缺血-再灌注損傷、鐮狀細胞病、不良刺激引起的心臟損傷,并可能對心力衰竭患者有益[18-21]。然而,過量的L-谷氨酰胺可以促進異常的血管生成和肺動脈高壓的發展。在這些情況下,L-谷氨酰胺水解酶的靶向治療,如谷氨酰胺酶-1、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶和氨基酸轉氨酶在動物模型中顯示出了應用的前景[17]。

假尿嘧啶是t RNA 和r RNA 中最常見的修飾核苷,被認為可以改善RNA 分子的結構完整性,促進磷酸基的剛性和增強堿基的堆疊。與年齡匹配的健康對照組相比,在射血分數降低的心力衰竭患者中發現了更高的假尿嘧啶血漿濃度[22]。早期的研究表明,當與利鈉肽相比較時,假尿嘧啶對射血分數降低的患者具有更好的診斷能力[23]。而N 末端前體利鈉肽是目前臨床用于促進心力衰竭診斷的“金標準”代謝物。因此,假尿嘧啶不僅有助于心衰病例的診斷,而且這種代謝物的測量也有可能作為一種新的臨床工具來識別無疾病但未來心衰風險高的個體。

黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤氧化成尿酸[24]。尿酸是人類嘌呤代謝的最終產物,不僅是痛風的病因,而且在心血管疾病的發展中發揮作用[25-26],如高血壓、心房纖顫、慢性腎病、心力衰竭、冠狀動脈疾病和心血管死亡?；A實驗研究已經確認尿酸是一種抗氧化劑[27],尿酸可誘導血管內皮細胞和平滑肌細胞炎癥,以及細胞內氧化應激,導致內皮功能障礙。在嘌呤代謝過程中,黃嘌呤氧化酶的活性產生氧,促進炎癥反應,損害內皮功能。內皮作為一種內分泌器官,分泌血管擴張劑和血管收縮劑,調節血管張力、血栓形成、炎癥和氧化[28]。內皮功能障礙是指內皮源性血管擴張因子和血管收縮因子之間的不平衡干擾內穩態的一種情況。盡管存在諸多混雜因素,在不同人群中,通過不同的內皮功能測試(如流量介導的擴張、反應性充血指數和冠狀動脈內乙酰膽堿測試)評估,尿酸水平升高與內皮功能障礙顯著相關。盡管尿酸本身是否是引發炎癥、氧化應激和內皮功能障礙的因果關系仍有爭議,但這些途徑目前是尿酸與心血管疾病之間關系的假設機制。

綜上所述,本研究結果顯示PS可導致子代大鼠心臟組織中L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、尿酸、黃嘌呤、2＇-脫氧腺苷5＇-單磷酸、胞氨酸3＇-單磷酸、胞氨酸5＇-單磷酸水平上調,精氨琥珀酸水平下調。根據文獻報道,L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、尿酸、黃嘌呤與心血管疾病密切相關,后續實驗有待進一步證明PS與心血管疾病的功能性驗證。2＇-脫氧腺苷5＇-單磷酸、胞氨酸3＇-單磷酸、胞氨酸5＇-單磷酸水、精氨琥珀酸尚未見報道與心血管疾病相關,這些分子為研究PS與子代大鼠心臟疾病相關的實驗提供了新思路。