參芍消瘤方含藥血清對人肝癌細胞生物學行為的影響

丁曉明 張賢梅 柯亭 昝俊杰 孫勤國

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）是全球第六大常見惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的第四大原因[1-2]，具有高發病率和高死亡率，患者常規治療后存在預后不良和容易復發等臨床問題[3-4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路是調節細胞周期、增殖、凋亡和代謝的重要信號機制，針對該通路研發的抑制劑在治療肝癌方面具有較大臨床應用價值[5-7]。中藥以低毒、多因素、多途徑靶向等優點長期應用于臨床，具有開發抗肝癌天然新藥的巨大潛力[8]。靶向抑制PI3K/Akt 途徑的天然藥物被認為是很有前途的抗肝癌藥物[9]。麝黃消瘤方是成肇仁教授治療肝癌的臨床經驗方，可有效抑制肝癌細胞的增殖、侵襲等生物學行為[10-11]。參芍消瘤方由麝黃消瘤方改進而來，是武漢市第三醫院應用多年的治療PLC 協定方。前期臨床數據顯示，參芍消瘤方可改善乏力、腹脹、脅痛等癥狀，改善PLC 患者因介入治療、放療等導致的不良反應，延長患者生存時間，提高生活質量[12]。但參芍消瘤方對人PLC 細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響尚不明確。本研究采用含參芍消瘤方的血清作用于人PLC 細胞，觀察細胞增殖、凋亡、細胞周期、遷移和侵襲等生物學行為，與常用抗癌藥物順鉑聯合使用，探討中西藥物結合使用對人PLC 細胞生物學行為的影響，旨在為PLC藥物研發提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及細胞 SPF級SD大鼠5只，雄性，7～8周齡，體質量250～280 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物合格證：No.430727221100343247。于SPF 級環境中適應性喂養6 d 后進行實驗。人肝癌細胞Bel-7402 購于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。RPMI 1640（批號：SH30809.01B）購自美國Hyclone 公司，凍存；使用時37 ℃水浴解凍，加入10%FBS和1%青霉素、鏈霉素雙抗。細胞在5%CO2、70%濕度、37 ℃細胞培養箱中培養，待細胞密度達80%時傳代培養。

1.2 主要試劑 FBS（批號：c11095500bt）購自美國Gibco 公司。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）細胞增殖檢測試劑盒（批號：C10310-1）購自廣州銳博生物技術有限公司。碘化丙啶（propidine iodide，PI）/Rnase 染色緩沖液、AnnexinVFITC/PI 凋亡檢測試劑盒（批號：556547）購自美國BD公司。細胞計數試劑盒-8（cell-counting kit-8，CCK-8）（批號：CA1210）、結晶紫（批號：C8470）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司。兔抗PI3K 抗體（批號：PAB30084）、兔抗Akt抗體（批號：PAB30596）、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease 3，Caspase-3）抗體（批號：PAB30047）和兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號：PAB36269）均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。兔抗磷酸化PI3K（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體（批號：ab278545）購自英國Abcam 公司。兔抗磷酸化Akt（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號：4060T）購自美國CST公司。

1.3 參芍消瘤方制備 該方包含丹參15.0 g，白芍15.0 g，黃芪15.0 g，白術10.0 g，茯苓10.0 g，白花蛇舌草15.0 g，黨參12.0 g，莪術10.0 g，八月札10.0 g，郁金10.0 g，焦山楂20.0 g，麝香0.1 g，牛黃0.3 g，柴胡6.0 g，炮甲6.0 g，鱉甲15.0 g。所有藥物均購自武漢市第三醫院藥房。麝香、牛黃研磨至細末，待用；余藥加水1 000 ml 浸泡1 h，煎煮30 min，去渣再加入麝香、牛黃細末，再煎煮25 min，使湯藥溶液濃縮至48.00 ml。密封，4 ℃保存備用。

1.4 含藥血清制備 取28.57 ml 湯藥液加入71.43 ml 0.9%氯化鈉溶液配置成100.00 ml 藥液。給大鼠灌胃1 次/d，10.00 ml/kg，連續5 d。最后1 次灌胃后1 h，采用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血3.00 ml，3 000 r/min 離心10 min，吸取上層血清，置于56 ℃水浴中滅活30 min，-80 ℃冰箱保存備用。

1.5 藥物濃度及干預時間篩選 采用CCK-8 法。取Bel-7402細胞接種于96孔板，調整密度至3×103/孔；培養至細胞貼壁，棄去上清液，加入含0、15%、20%、25%和30%體積分數含藥血清的RPMI 1640 培養基，100 μl/孔，培養24、48 和72 h。加入10 μl CCK-8 溶液，繼續培養4 h。酶標儀檢測450 nm 處的吸光值，分別計算細胞抑制率，篩選含藥血清干預的最佳體積分數和時間。

1.6 實驗分組及處理 取正常培養細胞，分為對照組、含藥血清組、順鉑組、含藥血清+順鉑組。對照組使用常規RPMI 1640，含藥血清組細胞使用含25%含藥血清的RPMI 1640，順鉑組使用含5 mmol/L 順鉑的RPMI 1640[13]，含藥血清+順鉑組使用25%含藥血清和含5 mmol/L 順鉑的RPMI 1640。正常培養24～48 h，待用。

1.7 指標測定

1.7.1 細胞增殖數量的檢測 采用EdU 染色法。收集各組細胞轉移至6 孔板，加入含100 μl EdU（50 μmol/L）的培養基。孵育2 h 后，加入100 μl/孔含4%多聚甲醛的PBS 室溫繼續孵育30 min。根據EdU 細胞增殖檢測試劑盒說明書方法，先后加入100 μl Apollo?染色反應液和100 μl Hoechst 33258 反應液，均避光搖床孵育30 min。使用熒光顯微鏡觀察染色情況，EdU 染色后呈紅色（細胞DNA 染色），Hoechst 33258 染色后呈藍色（細胞核染色），將DNA 染色和核染色圖疊加合并呈圖，比較各組細胞數量的變化。

1.7.2 細胞周期檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞轉移至6 孔板，正常培養，調整細胞密度為1×107/孔，1 350 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，PBS 重懸后，加入700 μl 無水乙醇，-20 ℃固定24 h。取出細胞，4 ℃，1 787 r/min 離心5 min，加入1.00 ml PBS 洗滌細胞2 次。加入0.5 ml PI/Rnase 染色緩沖液重懸細胞沉淀，室溫孵育15 min。流式細胞儀上機檢測細胞DNA 含量，確定待測細胞在細胞周期（G1期、S 期和G2期）所占比例，利用NovoExpress 軟件進行結果分析。

1.7.3 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞轉移至6 孔板，正常培養，調整細胞密度為1×106/孔，1 350 r/min 離心5 min。加入200 μl PBS 重懸細胞，加入10 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μl PBS，流式細胞儀上機檢測處于第二象限（Q2-2）和第四象限（Q2-4）的細胞所占比例，利用NovoExpress 分析軟件進行分析。

1.7.4 細胞遷移能力的檢測 采用劃痕法。使用6 孔板培養各組細胞，背后用馬克筆豎著均勻畫5 條直線，橫穿過孔。調整細胞密度為1×106/孔，培養過夜。用無菌槍頭垂直于背后直線劃痕。PBS 清洗去劃下的細胞，分別于0、48 h 拍照，比較不同分組細胞劃痕寬度變化幅度，計算劃痕閉合率，以此判斷各組細胞遷移能力。

1.7.5 細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell 法。Transwell 小室用PBS 浸泡5 min 后取出，底部鋪80 μl基底膠，靜置30 min。收集各組細胞，用含1% FBS 的培養基調整細胞密度為1×106/ml。小室上室中加入0.50 ml 細胞懸液，下室中加入0.75 ml 含10% FBS 的培養基，培養24 h。加入1.00 ml 4%多聚甲醛固定20 min，加入1.00 ml/孔0.5%結晶紫溶液，染色30 min。擦去小室內沒有侵襲的細胞，顯微鏡下觀察并計數視野中的侵襲細胞數。

1.7.6 細胞p-PI3K、p-AKT 和Caspase-3 蛋白表達的檢測 采用Western blot 法。各組取1×106個細胞進行裂解，提取細胞總蛋白。BCA 法進行蛋白定量后，SDS-PAGE 電泳分離。轉膜、封閉。加入一抗（稀釋比1∶1 000）室溫孵育1 h，洗膜。加入二抗室溫孵育1 h，洗膜。加入化學發光試劑，顯影曝光。采用圖像處理軟件Image J 計算各蛋白條帶灰度值，檢測p-PI3K、p-Akt 和Caspase-3 蛋白表達水平。

1.8 統計學處理 采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 含藥血清作用濃度及時間篩選 隨培養基中加入的含藥血清體積增加，細胞抑制率逐漸升高，在25%時達到穩定。隨培養時間延長，含藥血清對細胞抑制率逐漸升高，在48 h 達到穩定，見圖1。因此，選擇含25%參芍消瘤方血清的培養基處理細胞，培養時間為48 h。

圖1 培養基含藥血清濃度及培養時間篩選（A：血清體積；B：培養時間）

2.2 含藥血清對細胞增殖數量的影響 與對照組相比，含藥血清組和順鉑組EdU 染色陽性細胞數顯著減少（均P＜0.05），即細胞增殖能力下降；與順鉑組相比，含藥血清+順鉑組EdU 染色陽性細胞數顯著減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2（插頁）。

圖2 含藥血清對細胞增殖數量的影響（A：4 組細胞增殖情況，×200；B：4 組細胞EdU 染色陽性數比較）

2.3 含藥血清對細胞凋亡及細胞周期的影響 與對照組比較，含藥血清組和順鉑組細胞凋亡率和S 期細胞占比顯著升高（均P＜0.05）；與順鉑組比較，含藥血清+順鉑組細胞凋亡率和S 期細胞占比顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 含藥血清對細胞凋亡及細胞周期的影響（A：4 組細胞凋亡情況；B：4 組細胞凋亡率比較；C：4 組細胞周期情況；D：4 組細胞S期占比比較）

2.4 含藥血清對細胞遷移和侵襲能力的影響 與對照組比較，含藥血清組和順鉑組細胞遷移速度減慢，侵襲細胞數量顯著減少（均P＜0.05）；與順鉑組比較，含藥血清+順鉑組細胞遷移減慢，侵襲數量顯著減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 含藥血清對細胞遷移和侵襲能力的影響（A：各組細胞遷移情況，×100；B：各組細胞劃痕閉合率比較；C：各組細胞侵襲情況，×200；D：各組細胞侵襲數量比較）

2.5 含藥血清對細胞Caspase-3 和PI3K/Akt 通路蛋白表達的影響 與對照組比較，含藥血清組和順鉑組細胞p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平顯著降低，Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與順鉑組比較，含藥血清+順鉑組細胞p-PI3K和p-Akt 蛋白表達水平均顯著降低，Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖5。

圖5 含藥血清對細胞p-PI3K、p-Akt 和Caspase-3 蛋白表達影響（A：蛋白電泳圖；B：蛋白表達的比較）

3 討論

傳統醫學中并無“肝癌”這一病名，隨著時代發展，當代醫生在傳統中醫理論指導下，逐漸對其病因形成一定認識[14]。氣滯血瘀是腫瘤形成發展的主要病理機制，氣滯可致血瘀，血瘀亦能加重氣滯，故疏肝理氣法是治療本病的主要治法之一?！督饏T要略》言“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”。故健脾益氣法在肝癌及其轉移的治療中是一種極其重要的方法。參芍消瘤方中牛黃清熱化痰，散結解毒消腫；麝香辛香走竄，活血通絡止痛，并助牛黃化痰散結消腫；丹參活血化瘀，涼血消癰；莪術為血中氣藥，行氣破血消積；柴胡疏肝理氣行血，配以白芍養血柔肝，緩急止痛；黃芪、黨參、白術、茯苓健脾益氣以助中土，使脾氣行則氣血行，痰水消；炮甲善疏通經絡、活瘀血、消癰腫、治惡瘡；蛇舌草清肝熱，解邪毒，抗癌消癥。全方共奏清熱解毒，活血破瘀消癥，軟堅散結，健脾理氣之功。血清藥理學是一種利用動物含藥血清進行中藥體外藥理研究的藥理學方法，具有體外實驗和體內實驗的優點，在中藥藥理研究中被廣泛應用[15-16]。本研究制備參芍消瘤方含藥血清作用于人肝癌細胞Bel-7402，結果顯示含藥血清可有效抑制Bel-7402 細胞增殖、遷移與侵襲，含藥血清與順鉑聯合使用對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用比順鉑單獨使用更好，提示參芍消瘤方含藥血清可有效抑制Bel-7402 細胞增殖與轉移，建議與順鉑聯合使用。

不受控制地增殖和細胞長時間存活是癌細胞的主要特征，腫瘤的形成是各種細胞周期調節因子異常表達導致染色體不穩定或凋亡途徑改變的結果[17]。大量研究顯示，激活PI3K/Akt 信號通路可促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[18-19]。Caspase-3 是線粒體凋亡途徑相關蛋白，Caspase-3 蛋白表達上調時，肝癌細胞凋亡增加，Akt/Caspase-3 通路在肝癌細胞增殖、凋亡和轉移等生物學行為中發揮重要作用[20-22]。本研究結果顯示，參芍消瘤方含藥血清干預Bel-7402 細胞后，誘導細胞周期阻滯，細胞凋亡率顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 通路蛋白表達水平顯著降低，Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高，含藥血清與順鉑聯合使用對細胞周期、凋亡及PI3K/Akt 通路蛋白的作用比順鉑單獨使用更好，提示參芍消瘤方可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路調控Bel-7402 細胞的周期、凋亡等生物學行為。

綜上所述，參芍消瘤方含藥血清可抑制Bel-7402細胞增殖、遷移、侵襲，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，且與抗癌藥物順鉑聯合使用后對人肝癌細胞Bel-7402 生物學行為的影響優于順鉑單獨作用，其作用機制可能與抑制PI3K/Akt 信號通路有關。后期研究可關注參芍消瘤方活性成分的分析，結合網絡藥理學與基礎實驗驗證，為挖掘參芍消瘤治療肝癌的潛在靶點提供支持。