MICAL2、miR-340-5p在胃癌組織中的表達及其臨床意義

段戰鋒,張巍巍,申曉燕

(河南省許昌市中心醫院鹿鳴湖院區1.腫瘤內科二病區,2.胃腸外科,河南 許昌 461000)

胃癌是人類消化系統最常見的惡性腫瘤之一[1]。它是全球癌癥相關死亡的第二大原因,雖然目前針對胃癌的臨床治療有多種選擇,但術后復發和轉移是胃癌治療的最大障礙[2],且患者的預后很差,尤其是在腫瘤晚期[3]。胃癌患者的5年總生存率僅約30%[3]。這主要是由于對癌癥異質性的了解較少,以及缺乏理想的生物標志物用于早期檢測。因此,確定胃癌的分子特征,尋找新的診斷和治療靶點是當前研究的重點。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種小型非編碼RNA,可以調節RNA轉錄,進一步促進或抑制腫瘤基因表達。到目前為止,數據庫中已經鑒定和報道了一千多個人類miRNA[4],其中一些已經被用作診斷、預后和治療的分子生物標志物。miR-340-5p是一種研究較少的miRNA,但已有證據表明其在包括癌癥在內的許多疾病中發揮重要作用[5-7]。MICAL2(Molecule interacting with Cacl 2)是MICALs家族的一個特殊成員,已被確定為多種癌癥的腫瘤促進劑,包括前列腺癌、胃癌、乳腺癌和結腸直腸癌,參與細胞遷移、侵襲、變形和增殖[8]。尚不清楚miR-340-5p是否通過靶向MICAL2參與胃癌的發生。因此,本研究通過檢測胃癌組織中MICAL2、miR-340-5p的表達,探討二者在胃癌組織中的作用及關系,現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2018年6月本院收治的胃癌患者為研究對象,收集96例手術患者的胃癌組織及離腫瘤邊緣5 cm處的癌旁組織。離體組織迅速置于液氮中冷凍,之后轉移到-80 ℃保存至使用,且所有標本均經組織病理學證實?；颊咧心?6例,女30例。

根據腫瘤-淋巴結轉移(TNM)分期系統對腫瘤進行分期,Ⅰ期和Ⅱ期共35例,Ⅲ期和Ⅳ期共61例。組織學分級按照國家綜合癌癥網絡(NCCN)腫瘤學臨床實踐指南進行評估。納入標準:(1) 首次確診,未采用其他治療方案治療;(2) 通過影像學檢查、病理檢查確診為胃癌患者。排除標準:(1) 合并其他惡性腫瘤者;(2) 造影劑過敏者;(3) 有慢性胃炎、胃出血、胃穿孔等胃部疾病者;(4) 臨床資料不完整者。本研究經我院道德倫理委員會批準通過,所有樣品采集均取得受試者知情同意,符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測組織中miR-340-5p水平 使用TRIzol試劑(Ambion,USA)從組織樣品中提取總RNA,取1 μg總RNA作為模板,采用反轉錄試劑盒進行反轉錄,獲得cDNA。采用GoTaq qPCR Master Mix(Promega)在Mx3005P Real-time PCR系統(Stratagene,USA)上進行qRT-PCR。反應條件為:95 ℃ 10 min預變性,95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;共循環45次。以U6作內參基因,采用2-ΔΔCT法對組織miR-340-5p表達水平進行定量分析。miR-340-5p及內參引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.2 免疫組織化學染色觀察組織中MICAL2蛋白表達情況 免疫組化分析采用EnVision兩步法進行。操作按照實驗室程序和試劑盒說明書進行。將保存的胃癌以及癌旁組織標本進行石蠟切片,常規脫蠟、水合,3%雙氧水作用8 mim去除內源性酶活性,檸檬酸修復抗原,PBS沖洗3次,每次3 min,除去PBS后加入一抗(MICAL2兔多克隆抗體)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗后加入二抗37 ℃孵育20 min,DAB染色,蘇木精復染。脫水、透明后封片,PBS代替一抗作為陰性對照。

對染色結果進行病理圖像分析,于光學顯微鏡下觀察,根據顯色強度和陽性細胞百分率綜合計分。細胞膜和細胞質中未觀察到棕黃色顆粒狀沉淀為0分,細胞膜及細胞質呈淡黃色顆粒狀沉淀為1分,細胞膜和細胞質呈現淺棕色顆粒狀沉淀為2分,細胞膜和細胞質呈現棕黃色顆粒狀沉淀為3分;陽性細胞百分率<10%為1分,陽性細胞百分率10%～50%為2分,陽性細胞百分率>50%為3分。綜合計分為以上兩種評分相加,≤3分為低表達,>3分為高表達。

1.2.3 Western-blot法檢測MICAL2蛋白表達水平 將組織樣品置于含有蛋白裂解劑的冰中孵育30 min,然后在4 ℃下離心30 min,利用二辛可寧酸(BCA)進行蛋白質定量。取50 μg總蛋白質進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉2 h后,將膜與MICAL2一抗[貨號:ab241260,艾博抗(上海)貿易有限公司]和GAPDH[貨號:ab8245,艾博抗(上海)貿易有限公司]在4 ℃下孵育過夜。然后用TBS-Tween-20(TBST)洗滌膜,并與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的二抗[貨號:ab9482,艾博抗(上海)貿易有限公司]在室溫下放置60 min。用TBST洗滌后,使用增強型化學發光系統(EMD Millipore)對膜進行顯影。使用ImageJ 2.1軟件對蛋白表達水平進行定量。

1.3 隨訪

所有患者自術后開始門診或者電話定期隨訪,觀察患者的生存時間和生存率,隨訪截止時間為2021年6月,終點事件為患者死亡。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中miR-340-5p表達水平的比較

胃癌組織中miR-340-5p表達水平高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌組織與癌旁組織中miR-340-5p表達水平的比較Tab 2 Comparison of miR-340-5p levels in gastric cancer tissues and adjacent

2.2 胃癌組織和癌旁組織中MICAL2蛋白的表達情況

胃癌組織中MICAL2蛋白陽性表達率為71.88%(69/96),癌旁組織中MICAL2蛋白陽性表達率為11.46%(11/96),差異有統計學意義(χ2=72.086,P<0.001)。胃癌患者組織中MICAL2蛋白的表達水平高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1、表3。

圖1 MICAL2蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達Fig 1 Expression of MICAL2 protein in gastric cancer and adjacent tissues

表3 胃癌組織與癌旁組織中MICAL2蛋白表達水平的比較Tab 3 Comparison of MICAL2 protein expression levels in gastric cancer tissues and adjacent

2.3 胃癌患者中MICAL2、miR-340-5p表達的相關性

Pearson法分析結果顯示,胃癌患者組織中MICAL2表達與miR-340-5p表達呈正相關,差異有統計學意義(r=0.313,P<0.05)。見圖2。

圖2 胃癌患者中MICAL2表達與miR-340-5p表達的相關性Fig 2 Correlation between MICAL2 and miR-340-5p expression in patients with gastric cancer

2.4 MICAL2蛋白和miR-340-5p表達與胃癌患者臨床病理參數的關系

胃癌組織中MICAL2蛋白和miR-340-5p表達與年齡、性別、分化程度、浸潤程度、腫瘤大小無關(P>0.05),與淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)。見表4。

表4 胃癌組織中MICAL2蛋白、miR-340-5p的表達與臨床病理參數的關系Tab 4 Relationship between the expression of MICAL2 protein, miR-340-5p and clinicopathological parameters in gastric cancer tissues

2.5 Kaplan-Meier生存分析

96例患者均完成3年隨訪,末次隨訪日期2021年6月30日,共32例死亡,64例存活。以miR-340-5p、MICAL2相對表達量均值為基準,超出該范圍判定為高表達,低于該范圍定義為低表達。繪制3年生存曲線,Kaplan-Meier分析結果顯示,miR-340-5p高表達組患者3年累積生存率(80.00%)顯著低于低表達組(52.17%)(Log rankχ2=9.096,P=0.003),MICAL2蛋白高表達組患者3年累積生存率(72.46%)顯著低于低表達組(51.85%)(Log rankχ2=4.329,P=0.037),見圖3。

圖3 不同MICAL2、miR-340-5p表達患者Kaplan-Meier生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival curve of patients with different MICAL2 and miR-340-5p expressions

2.6 影響胃癌患者預后的Cox回歸分析

以是否死亡為因變量,miR-340-5p、MICAL2、淋巴結轉移、TNM分期為自變量進行Cox回歸分析,結果顯示MICAL2、miR-340-5p、淋巴結轉移、TNM分期均是影響患者預后的危險因素(P<0.05),見表5。

表5 影響胃癌患者預后的Cox回歸分析Tab 5 Cox regression analysis of influence on prognosis of patients with gastric cancer

3 討 論

胃癌早期癥狀與一般胃病相似,是一種發病隱匿的惡性腫瘤,被發現時通常已處于腫瘤晚期[9]。目前,我國每年新增多達40萬胃癌病例,其發病率僅次于肺癌,死亡率僅次于肺癌和肝癌,已成為威脅民眾健康的重大疾病之一[10-13]。因此,早發現、早診斷、早治療是提高療效和生存率的關鍵。

miRNA是由20～24個核苷酸組成的非編碼小RNA分子,主要參與各種細胞活動的轉錄調控[14]。然而,miRNA的異常改變與多種生物學過程有關,包括腫瘤形成、血管生成和脂質代謝的改變。它們通常通過靶向癌基因、腫瘤抑制基因、轉錄因子以及其他涉及細胞死亡和生存的調控因子來調節腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥性[15]。miR-340被報道為乳腺癌的抑制性miRNA[16]。對結直腸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃癌的研究證實,miR-340在癌細胞的增殖、遷移和侵襲中發揮抑制作用[17-18]。Xiao等[19]研究發現,miR-340-5p在胃癌組織中表達顯著上調,表明miR-340可能在胃癌中發揮促癌作用。本研究發現,胃癌組織中miR-340-5p表達水平顯著高于癌旁組織,胃癌組織中miR-340-5p表達與年齡、性別、分化程度、浸潤程度、腫瘤大小無關,與淋巴結轉移、TNM分期有關,提示miR-340-5p可能參與胃癌的發展進程,推測miR-340-5p水平的升高可能通過促進淋巴結轉移累及其它器官或系統,促使癌癥惡化。本研究Kaplan-Meier分析顯示,miR-340-5p高表達組患者3年累積生存率顯著低于低表達組,提示miR-340-5p表達水平還可影響預后。

MICAL2是MICALs家族的成員之一,MICALs是一個進化保守家族,涉及細胞生長、軸突引導、囊泡運輸和細胞凋亡,參與細胞骨架動力學和相關基本生物過程的調控[20]。Zhou等[8]研究發現,MICAL2可促進肺腺癌的侵襲和生長。另有研究[21]發現,MICAL2在內皮細胞中的表達參與炎癥誘導的新血管生成,而誘導血管生成能力是公認的癌細胞特性。本研究通過免疫組織化學染色發現,胃癌組織中MICAL2蛋白陽性表達率為71.88%,顯著高于癌旁組織中的11.46%(11/96);進一步通過Western blot定量分析發現,胃癌組織中MICAL2蛋白表達水平顯著高于癌旁組織,胃癌組織中MICAL2蛋白表達與患者年齡、性別、分化程度、浸潤程度、腫瘤大小無關,與淋巴結轉移、TNM分期有關,提示MICAL2蛋白也與胃癌的惡性程度相關,可能通過影響炎癥誘導的新血管生成促進癌癥進展。Kaplan-Meier分析結果顯示,MICAL2蛋白高表達組患者3年累積生存率顯著低于低表達組,提示MICAL2蛋白表達水平可影響患者3年累積生存率。本研究進一步使用Pearson相關分析發現,胃癌組織中MICAL2與miR-340-5p表達水平呈正相關,提示二者在胃癌中可能存在正調控機制共同參與胃癌的發生發展并影響患者的預后。Cox回歸分析結果顯示,MICAL2和miR-340-5p高表達、淋巴結轉移、TNM分期均是影響患者預后的危險因素,提示對于MICAL2、miR-340-5p高表達的患者,應該在術后給予更嚴密的隨訪觀察,必要時給予輔助治療,以期改善預后。

綜上所述,MICAL2和miR-340-5p在胃癌組織中均呈現高表達,二者與胃癌病情發展和預后密切相關,有望成為新的胃癌靶標,為開發新的診治方法及判斷預后提供參考依據。但目前二者在胃癌發展中的確切機制尚不明確,需在今后進行更深入的研究。