HCV 復方制劑防治對蝦弧菌病藥效學研究

朱宇嘉，朱志東，董碧蓮，蔡延渠，辛年香，朱盛山

（1.廣州市普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510653；2.廣東藥科大學中藥開發研究所，廣東 廣州 510006）

根據聯合國糧農組織（FAO）2016 年的報告[1]，2015 年全球對蝦總產量達到691.5 萬t，產值約500 億美元。FAO 的統計數據顯示[2]，由于病害，目前全球對蝦養殖成功率不足30%。

近年來，對蝦弧菌病多發，對養殖生產造成較大影響。對蝦弧菌病即弧菌感染引起的傳染性疾病，我國對蝦養殖常見致病性弧菌包括：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, V.p）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi, V.h）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, V.a）等?；【≈饕Y狀包括：對蝦活力不足、游塘、吃料能力下降；蝦塘可見白便、死亡；體表觀察可見：肌肉白濁、空腸空胃、腸道發紅等；解剖觀察可見：肝胰腺萎縮、褪色、表層腐爛、白膜消失等?；【【哂泻軓姷膫魅拘?，感染率可達100%，發病嚴重的蝦池死亡率可達90%以上。2019 年，國際動物衛生組織（OIE）在報告中，列舉了包括抗生素、微生物制劑等熱門藥品，但無一能有效防治弧菌病。文獻[3]采用抗生素、蛭弧菌等藥品，在實驗室中開展治療弧菌病試驗，取得一定的效果，但在實際應用中效果不佳。目前全球尚無有效防治弧菌病的藥物。HCV 復方制劑（以下簡稱HCV）系中草藥提取物，成分包括半邊蓮花、土香薷、檵木葉等8 種植物?，F通過臨床試驗，驗證HCV 在養殖環境中防治弧菌病的藥效。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

時間為2019 年8 月13 日—10 月27 日。試驗地位于廣東省江門市。選擇14 口土塘（1?！?4＃），均為矩形，單個塘面積均為（7 337±1 334）m2，水深均為（1.2±0.2）m。設置1＃和2＃為空白組，3?！?4＃為用藥組。根據使用HCV 節點的不同，用藥組又分為全程預防組（3?！?＃）、早用藥組（7?！?0＃）和晚用藥組（11?！?4＃），每組各4 口塘。蝦塘基礎數據見表1，所有數據于投苗當天檢測。

表1 試驗蝦塘基礎數據

1.2 材料

試驗用HCV 復方制劑由廣東藥科大學中藥開發所制備；凡納濱對蝦（Litopenaeus Vannamei）蝦苗購自海大集團（海興農1 號苗），經檢測，桃拉綜合征病毒（TSV）、蝦血細胞虹彩病毒（SHIV）、蝦黃頭病毒（YHV）、對蝦白斑病毒（WSV）等均呈陰性；飼料（20 kg/包）購自廣東省陽江正大飼料有限公司。

1.3 弧菌病診斷

診斷依據主要為3 個癥狀：肝胰腺內有弧菌、吃料能力下降以及出現死蝦。

1.3.1 肝胰腺弧菌檢測

每5 d 檢測1 次對蝦肝胰腺弧菌，對病蝦用藥后連續檢測7 d，每天10：00—11：00（投喂藥料1 h 后）檢測1 次。檢測方法如下：從料臺隨機取5 尾腸道飽滿對蝦，將其放于蒸餾水中游15 min，剝離對蝦肝胰腺，于蒸餾水中浸泡5 min，后置于干凈器皿中，搗碎，收集至容器，加入0.2% NaCl 溶液至5 mL，搖勻。分別吸取0.05 mL 溶液，滴入5 個TCBS 培養皿中，涂勻。將培養皿于33 ℃恒溫箱放置18 h，取出觀察，計算培養皿中菌落數后，去除菌落數最多與最少的培養皿，選取剩余3 個皿的結果，求平均數。估算每個肝胰腺平均菌落數（即培養皿中菌落數100 倍），作為檢測結果。

1.3.2 記錄對蝦吃料量

養殖過程中，每天分別于06：00、11：00 和16：00投喂1 次。從投苗后第20 d 起，每次投料后，在料臺留約投喂量1%的飼料，觀察料臺，如飼料能在1.5 h 內吃完，則判斷對蝦已吃飽；如連續2 d 投料，對蝦能在1.5 h 內吃完，后一餐加料5%；如連續3 餐投料1.5 h 未吃完，則記錄蝦塘出現減料現象，并從下一餐起根據病情減料投喂。

1.3.3 記錄死亡量

對蝦瀕死時，喜聚集于增氧機底部等溶氧量較高的地方。于每日早晚，分別從蝦塘增氧機底部撈取死蝦，記錄總數。

1.4 HCV 復方用藥

1.4.1 全程預防組

從投苗當天開始，按每隔4 d 用藥2 d、1 次/d的方式用藥。10 萬尾蝦用藥量見表2。由投苗量、養殖階段與用藥量關系，計算HCV 復方用量（預防用量），采用對蝦30 min 的吃料量拌勻，晾10 min 后，全塘均勻潑灑。

表2 10 萬尾蝦用藥量mL

1.4.2 用藥組

每個療程均為連續用藥2 d、早晚各1 次的方式用藥。早用藥組：在對蝦出現減料現象且肝胰腺內檢測出弧菌時，開始用藥。晚用藥組：即對蝦出現連續2 d 死亡量＞5 尾或減料比例＞50%，同時肝胰腺內檢測出弧菌時，開始用藥。用藥量參照表2。

1.4.3 空白組

空白組不用任何可抑殺弧菌藥物（包括蛭弧菌、抗生素、HCV 復方等）。

2 結果與分析

2.1 養殖結果

空白對照組2 口蝦塘均持續出現減料和死亡現象，后因死亡量過大且無法遏制，分別在第40 和48 d 放棄養殖。全程預防組4 口試驗塘中，2 口塘未出現病情，2 口塘出現1 次減料現象。早用藥組中，4 口試驗塘均出現過不同程度的減料現象，其中2 口塘出現死亡現象。晚用藥組中，4 口試驗塘均出現死亡、減料現象。試驗塘養殖結果見表3。

表3 試驗池塘養殖結果

2.2 死亡量和吃料率

對蝦吃料率，即對蝦發病后用藥前一餐（1.5 h）吃料量占病前7 d 內最大吃料量的比例。

2.2.1 空白組

空白組吃料率下降到80%以下當天，記錄為d0，記錄d0 到d6（d0 后第6 天）死亡量和吃料率數據，見圖1（a）（b）。

圖1 空白組死亡量和吃料率

2.2.2 全程預防組

因全程未出現連續3 d 死亡且單日死亡量≥5尾現象，全程預防組死亡量未記錄。全程預防組中，2口蝦塘未出現減料現象，2 口塘出現。出現減料現象的池塘，第1 次用藥當天記為d0，d0 至d6（d0 后第6 天）吃料率記錄見圖2。

圖2 全程預防組用藥后吃料率

2.2.3 早用藥組

因全程未出現連續3 d 有死亡且單日死亡量≥5 尾現象，早用藥組死亡量未記錄。早用藥組4 口蝦塘均出現減料現象，以第1 次用藥當天為d0，d0至d6（d0 后第6 天）吃料率見圖3。

圖3 早用藥組吃料率

2.2.4 晚用藥組

以第1 次用藥當天為d0，晚用藥組d0 至d6（d0 后第6 天）死亡量、吃料率記錄見圖4（a）（b）。

圖4 晚用藥組死亡量、吃料率變化

2.3 肝胰腺弧菌量檢測

4 個試驗組肝胰腺弧菌量檢測結果見圖5。圖5 所示數值為各組蝦塘當天弧菌量平均值。全程預防組中，2 口塘（3#和5#）未出現病情，未用藥治療，故其檢測數據未在圖5 中體現。

圖5 用藥前后弧菌量檢測結果

試驗發現，空白組因病情無法遏制而放棄養殖；全程預防組基本不受弧菌病影響；治療用藥1 h后，肝胰腺弧菌被抑殺；早用藥組用藥2 d，吃料率回升；晚用藥組用藥后，吃料量上升，但至d6，所有試驗塘均未超過病前最高吃料量；晚用藥組d6，死亡現象基本消失。全程預防組平均產量是早用藥組的1.4 倍、晚用藥組的2.3 倍，早用藥組平均產量是晚用藥組的1.7 倍，可見預防優于治療，應及早用藥。

3 討論

3.1 抑菌與弧菌病防治效果對比

研究[4]發現，對于弧菌病，恩諾沙星、諾氟沙星、氟甲喹等至少需要連續用藥14 d，才可降低對蝦死亡率，用藥周期長。而HCV 使用1 次后，對蝦肝胰腺中弧菌被抑殺，吃料量均超出病前，死亡現象基本消失，相比上述抗生素更具速效優勢。蛭弧菌難以作用于發病部位[5-6]，HCV 用藥1 次后，可抑殺肝胰腺中弧菌，有效性優于蛭弧菌。文獻[7]測試了11 種常見植物提取物對5 種常見弧菌的最小抑菌濃度（MIC）值為5~40 g/L；文獻[8-9]測試厥藻類、石莼MIC 值為1.5 g/L。HCV 是由文獻[7]中NZ 處方及其提取工藝優化而來，MIC 為0.25 g/L，遠低于上述植物提取物。

3.2 藥效可行性

本試驗在室外養殖環境中完成，實驗室環境與蝦塘養殖環境主要區別是：（1）弧菌菌種不一致或致病弧菌并非單一弧菌；（2）養殖環境包括水質、天氣等因素多變且每口塘之間存在差異性；（3）對蝦健康程度、發病時間、療效觀察等存在差異。

FAO、OIE 在報告[2，10]中指出，目前仍無可防治弧菌病藥物。HCV 在養殖蝦塘試驗中，成功防治弧菌病，顯著提高了養殖收益，不僅解決無藥可治這一難題，還為研制防治對蝦弧菌病中草藥新產品，提供了養殖環境試驗依據。

3.3 病情復發

早用藥組與晚用藥組在用藥治療后，出現病情復發現象，可能是再次感染弧菌。感染源可能來自蝦塘環境中，尤其是底泥中的弧菌，以及活蝦啃食感染弧菌的死蝦。因此，弧菌病復發率高，需加強預防。