基于微衛星標記的中華絨螯蟹遺傳多樣性分析

田間，馬行空，曾健成，王志紅，葛家春*

（1.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇省科技資源統籌服務平臺長江系中華絨螯蟹種質資源庫，江蘇 南京 210017；3.南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇 南京 210023）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又名河蟹、大閘蟹，隸屬于甲殼綱（Malacostraca），十足目（Decapoda），方蟹科（Grapsidae），絨螯蟹屬（Eriocheir）[1]，廣泛分布于我國長江中下游地區，是我國重要的經濟型蟹類之一，其營養豐富，肉質鮮美，市場認可度極高[2]。河蟹地理分布也十分廣泛，在我國形成了“長江蟹”“遼河蟹”“甌江蟹”三大蟹系，其中長江蟹以產量高、味道鮮美而聞名[3]。

20 世紀80 年代后期，由于過度捕撈、水利設施建設、水體污染和棲息地被破壞等因素，天然蟹苗資源急劇衰退[4]。目前，隨著河蟹養殖產業規模的壯大，天然苗種已無法滿足河蟹生產需求。人工育苗的開展，解決了大部分養殖企業、養殖戶的苗種需求，但引進多水系親本、小規格親本濫用等，出現了幼蟹培育成活率低、規格參差不齊、性早熟等現象[5-6]。河蟹種質問題已然成為制約河蟹產業發展的主要因素之一。在當前河蟹的群體選育過程中，由于多年連續選育且不引進外來親本，可能導致有害等位基因和無用性狀積累到河蟹種群中，有導致河蟹適應性和遺傳多樣性降低的風險[7]。因此，開展河蟹群體的遺傳多樣性研究，對遺傳育種極為重要。

微衛星，又名簡單串聯重復序列（SSR），或短串聯重復（STR），是以1~6 bp 的重復單位組成的串聯重復序列，具有數量多、多態性豐富和易于檢測等特點[8]。微衛星多年來被廣泛用作遺傳差異的標記，其中包括基因圖譜、種群遺傳學和法醫學[9]。目前，關于微衛星在河蟹遺傳多樣性方面的研究已有報道。熊良偉等[10]利用37 對微衛星標記，構建了河蟹家系遺傳圖譜。李曉暉等[11]利用10 對微衛星標記，對長江水系3 個選育群體和野生群體進行了遺傳分析。許志強等[12]用6 對微衛星標記對4個水系河蟹天然群體進行了遺傳多樣性分析。

現于2021 年利用6 個多態性豐富的微衛星分子標記，比較分析了單年系F5 代選育群體、“長江2 號”和長江野生群體的遺傳多樣性以及群體間的遺傳分化，以期為河蟹的良種選育和種質資源保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于江蘇省淡水水產研究所揚中基地和長江通江河道（非禁捕區域），采集3 個河蟹群體同屬奇數年群體，共90 個河蟹個體（表1），運輸至實驗室后，于-20 ℃保存。

表1 3 個群體河蟹樣本采集信息

1.2 DNA 提取與檢測

剪取河蟹附肢肌肉50~80 mg，于1.5 mL 離心管中，加入裂解液和蛋白酶K 混勻，于55 ℃水浴鍋消化1.5 h，直至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase A，于37 ℃水浴鍋消化1 h。按照傳統酚、三氯甲烷和異戊醇法提取組織DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度和完整性，超微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測其質量濃度，稀釋至50 μg/L，于-20 ℃保存備用。

1.3 PCR 反應體系、反應程序及擴增產物的檢測

用6 對已報道的具有多態性的微衛星引物，分析3 個河蟹群體的遺傳多樣性（表2）。PCR 反應體系總體積：2×Taq Plus Master Mix II（Vazyme，南京）12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴增反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火45 s；72 ℃延伸45 s，34 個循環；72 ℃延伸5 min。PCR 反應結束后，產物于4 ℃保存。

表2 河蟹6 個微衛星位點的引物信息

用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色，檢驗PCR 擴增產物多態性。銀染后，凝膠由Tanon 凝膠成像儀掃描成像。

1.4 數據統計與分析

等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon指數（I）、Nei氏遺傳距離和遺傳相似度，采用Popgen 1.32 軟件計算；多態信息含量（PIC）采用Cervus 3.0 軟件計算。群體間遺傳分化指數（Fst）、群體分子方差分析（AMOVA），采用Arlequin 3.5 軟件計算。系統樹根據Nei氏遺傳距離通過MEGA 5 軟件，采用非加權配對算數平均法（UPGMA）構建。

2 結果與分析

2.1 微衛星位點多態性

6 個微衛星位點的遺傳多樣性參數見表3。6 個微衛星位點共檢測出53 個Na，值為7~11，每個位點平均有17 個。Ne為4.539 4~9.529 4，平均值為7.100 3。I為1.668 3~2.312 3，平均值為2.023 3。Ho為0.638 9~0.861 1，平均值為0.745 4。He為0.790 7~0.907 7，平均值為0.862 2。PIC為0.779 7~0.895 1，平均值為0.850 2。根據Botstein等[14]的標準，PIC≥0.5 為高度多態性。本研究中的6 個位點均為高度多態性位點，說明這些位點均可提供豐富的遺傳信息，能夠有效地進行河蟹群體遺傳多樣性評估。F檢驗數據顯示，在6 個位點中，有1 個位點的近交系數（Fis）值為負值，其余5 個位點為正值，表明近交程度較高。6 個位點遺傳分化指數（Fst）的平均值為0.066 1。根據Wright 建議，4 個位點遺傳分化程度中等（0.05

表3 6 個微衛星位點的遺傳多樣性參數①

2.2 3 個河蟹群體的遺傳多樣性

3 個河蟹群體的遺傳多樣性見表4。由表4可見，長江野生群體的Na（7.666 7）、Ne（5.718 3）、I（1.909 9）、Ho（0.780 0）均為最高。所有群體的PIC均＞0.5，表明群體的遺傳多態性較高，具有較大的選擇潛力。

表4 3 個河蟹群體的遺傳多樣性

2.3 群體遺傳結構

群體間的遺傳分化指數見表5。由表5 可見，3個河蟹群體間Fst為0.052 69~0.084 82，其中單年系F5 代選育群體與長江野生群體體間遺傳分化系數最大（Fst=0.084 82），各群體間均屬于中等程度的遺傳分化（0.05

表5 群體間的遺傳分化指數（Fst）

群體的分子方差分析見表6。由表6 可見，群體間變異占總變異的5.34%，且達到顯著水平（P<0.05），94.66%的遺傳變異來自種群內個體間，這表明個體間的遺傳變異遠大于群體間的遺傳變異，遺傳變異主要存在于個體間。

表6 3 個河蟹群體的分子方差分析①

3 個河蟹群體的遺傳相似度和遺傳距離見表7（以“****”為界，右上角為遺傳相似度，左下角為遺傳距離）。由表7 可見，3 個群體的Nei氏遺傳距離為0.402 8~0.469 3。單年系F5 代選育群體與長江野生群體間的Nei氏遺傳距離最遠（0.469 3），遺傳相似度最低（0.568 5）。單年系F5 代選育群體與“長江2 號”群體Nei氏遺傳距離最近（0.402 8），遺傳相似度最高（0.688 5）。

表7 3 個河蟹群體的遺傳相似度和遺傳距離

基于Nei’s遺傳距離構建的3 個河蟹群體的UPGMA 系統進化樹見圖1。由圖1 可見，單年系F5代選育群體首先與“長江2 號”群體聚為一類，再與長江野生群體聚為一類。

圖1 基于Nei’s 遺傳距離構建的3 個河蟹群體的UPGMA 系統進化樹

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

基因雜合度是反映群體遺傳變異的一個最適參數，微衛星位點平均雜合度反映了遺傳結構變異程度高低，雜合度越大則變異越大，群體的穩定性越高，選擇潛力越大[15]。本研究中，3 個河蟹群體的He介于0.817 6~0.847 8。許志強等[12]于2009 年收集了4 個河蟹群體，平均He為0.714 9 ~0.758 5；李晶晶等[16]于2012—2013 年收集了4 個河蟹群體，平均He為0.720~0.745，其值均低于本研究。Botstein等[14]研究表明，當PIC≥0.5 時為高度多態性，當0.25≤PIC＜0.5 時為中度多態性。本研究中，3 個河蟹群體PIC值為0.784 1~0.812 5，均為高度多態性群體，表明其遺傳多樣性均處于較高水平，種質資源良好，有一定的種群穩定性，其中單年系F5 代選育群體和“長江2 號”2 個選育群體仍具有較大的選擇潛力。

Na和Ne的值越接近，等位基因在群體中分布的越均勻[17]。本研究中，3 個群體的平均Ne小于Na，不均勻程度大小依次為單年系F5 代選育群體、野生群體、“長江2 號”群體。主要原因是等位基因在群體中分布不均勻，導致等位基因的頻率不夠平均[18]。本研究中，長江野生群體等位基因數和有效等位基因數，均高于單年系F5 代選育群體和“長江2 號”群體，其原因可能是近年來的增殖放流，導致長江野生河蟹與其他水系河蟹基因交流增加，在一定程度上提高了長江野生河蟹的遺傳多樣性。

3.2 群體遺傳分化與遺傳距離

Fst是用來衡量群體間遺傳分化程度的重要參數。Balloux 等[19]認為，Fst值為0~0.05，表明群體間的遺傳差異很??；Fst值為0.05~0.15，表明群體間發生了中等水平的遺傳分化；為0.15~0.25 時，表明群體間存在較大的遺傳差異；當Fst>0.25 時，表明群體間高度遺傳分化。本研究中，3 個群體兩兩比較，遺傳分化Fst值為0.052 69~0.084 80，表明群體間均有不同程度的遺傳分化。單年系F5 代選育群體與“長江2 號”群體Fst值較?。?.052 69），此結果與實際生產情況相符，單年系F5 代選育群體部分親本來源于“長江2 號”群體。Karnosky 等[20]認為，異交物種來源于種群之間的遺傳變異應>90%，而本研究的分子方差分析（AMOVA）顯示，94.66%的遺傳變異來自種群內個體間，而來源于種群間的變異只有5.34%。這與劉青等[21]研究結果相似（群體間0.10%，部分變異來源于群體內個體間14.02%，絕大部分變異，來自個體內部85.88%）。表明3 個河蟹群體遺傳變異多發生在群體內個體之間，群體內個體差較大，存在雜合子缺失的現象[22]?；谶z傳距離的聚類分析，本研究中UPMGA 聚類樹結果與各群體間的遺傳距離結果一致，單年系F5 代選育群體與“長江2 號”群體遺傳距離較小，與長江野生群體的遺傳距離較大；聚類分析結果也表明，單年系F5 代選育群體先與“長江2 號”群體聚為一支，再與長江野生群體聚為一支。

4 結論

本研究以2 個人工選育群體和1 個野生群體為對象，應用微衛星分子標記技術分析各群體的遺傳多樣性和群體間的遺傳分化，結果表明，3 個群體的遺傳分化程度均處于較高水平，2 個河蟹人工選育群體具有較大的選育潛力。