缺血性腦卒中患者白細胞線粒體膜電位和線粒體呼吸鏈復合體活性變化及其與卒中后抑郁的關系

任長安 戚游 汪文娟

缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是腦卒中的主要類型,常見于50歲以上中老年人群,具有高發病率、高致殘率和高致死率的特點[1]。既往研究表明IS患者治療后常遺留不同程度神經根功能損害,不僅可導致日常生活自理能力下降,還可引起患者情感障礙,其中以卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)最為常見[2-4]。目前關于PSD詳細的發病機制尚未完全明確,王東等[5]研究表明IS患者PSD患病率高達36.4%,糖尿病、多發病灶以及神經功能缺損均為PSD的主要危險因素。近年來研究表明線粒體膜電位和呼吸鏈復合體活性與腦細胞缺血性損傷存在密切聯系,其機制可能與活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)介導的氧化損傷有關[6-7];王倩等[8]研究結果顯示右美托咪定可通過降低線粒體膜電位和減少線粒體呼吸鏈復合體活性損傷減輕老年患者全身麻醉手術后的認知功能損害。由此推測線粒體損傷可能在腦細胞缺血損傷和PSD發病中發揮重要作用。本研究對IS患者白細胞線粒體膜電位、線粒體呼吸鏈復合體活性變化及其與PSD的關系進行分析,以明確PSD發病機制并為臨床治療提供思路。

1 對象和方法

1.1 對象前瞻性收集2018年11月至2020年7月作者醫院收治的IS患者189例,其中男112例,女77例,年齡37～84歲,平均(57.4±11.3)歲。納入標準:(1)符合中華醫學會神經病學分會腦血管病學組《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》IS診斷標準[9];(2)年齡≥18歲;(3)發病至入院時間<24 h;(4)患者意識清醒并且可配合完成相關檢查;(5)入院前未接受抗凝、溶栓或神經營養等治療。排除標準:(1)合并惡性腫瘤、嚴重感染或冠心病等其他嚴重基礎疾病;(2)合并腦卒中、外傷或手術病史;(3)合并精神障礙、癡呆或神經系統病變;(4)合并失語或聽力障礙等因素所致交流溝通困難;(5)既往有酗酒或藥物濫用等病史者。脫落標準:(1)隨訪期間失訪或主動要求退出研究者;(2)發生突發意外事件無法繼續完成研究者;(3)患者因死亡或昏迷等原因導致臨床資料不完整者。本研究已通過作者單位醫學倫理委員會審批通過(WXFS-201811-006),且患者和家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1白細胞線粒體膜電位測量:采集患者入院第1天和隨訪結束時空腹外周靜脈血3 mL,置于EDTA-K2抗凝管,4℃以600g離心10 min后去除上清液,采用Coulter Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman公司)分離白細胞,采用PBS溶液沖洗5 min×3次。向白細胞中加入Trizol試劑(美國Invitrogen公司),使白細胞水平為1×106～1×107/500 μL,并反復抽吸至產生大量泡沫,室溫環境孵育5 min。然后加入三氯甲烷(與Trizol溶液體積比為1∶5),劇烈震蕩15 min后靜置10 min,4℃以11000g離心3 min,將上清液轉移至EP管并加入異丙醇(與Trizol溶液體積比1∶2),搖勻后室溫條件孵育10 min,再于4℃環境下以11000g離心3 min,去除上清液并向底層沉淀物中加入75%(體積分數)乙醇(與Trizol試劑體積等同),混勻后在4℃環境以9000g離心5 min,去除上清液并將沉淀物置于濾紙片上進行自然干燥,5 min后加入60 μL焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水溶液,溶解后加入JC-1染色液并37℃恒溫水浴30 min,采用流式細胞儀檢測熒光強度并分析線粒體膜電位,其中JC-1單體為綠色熒光,JC-1在線粒體內形成的聚合物呈紅色熒光,以紅/綠熒光強度比值表示膜電位大小。

1.2.2白細胞線粒體呼吸鏈復合體活性測量:取患者入院第1天和隨訪結束時空腹外周靜脈血3 mL,采用“1.2.1”方法分離并提純白細胞,然后采用ELISA法(試劑盒購自Beyotime公司)檢測白細胞線粒體呼吸鏈復合體I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ吸光度,檢測波長分別為340 nm、600 nm、550 nm和550 nm。通過標準曲線計算各復合體濃度。所用儀器為美國Agilent公司8453紫外-可見分光光度計。

1.2.3PSD隨訪和分組:均隨訪1年。隨訪結束時采用漢密爾頓抑郁量表(Hamiliton depression scale,HAMD)評估患者有無PSD及嚴重程度,內容包括抑郁情緒、負罪感及自卑感等共24項,總分<8分為無抑郁,≥8～<17分為輕度抑郁,≥17～<24分為中度抑郁,≥24分為重度抑郁,根據HAMD評分將患者分為PSD(≥8分)和非PSD(<8分)兩組,比較兩組性別、年齡和體質量指數(body mass index,BMI)等臨床資料和白細胞線粒體膜電位及白細胞線粒體呼吸鏈復合體活性的差異。

1.3 統計學處理采用SPSS25.0軟件進行統計學分析,計數資料采用χ2檢驗;滿足正態分布的計量資料采用均數±標準差表示,兩均數比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗;采用Pearson積差系數分析IS患者白細胞線粒體膜電位、線粒體呼吸鏈復合體活性與HAMD評分的相關性;采用受試者工作特征(ROC)曲線分析IS患者白細胞線粒體膜電位、線粒體呼吸鏈復合體活性變化對PSD的預測價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較189例患者失訪4例,死亡2例,自行退出研究1例,共脫落7例(3.70%),共182例患者進入分析。發生PSD共73例(40.11%),其中輕度29例(39.73%)、中度26例(35.62%),重度18例(24.66%)。PSD組和非PSD組性別構成、年齡以及BMI等臨床基本資料比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。結果見表1。

表1 PSD組和非PSD組臨床資料比較

2.2 兩組患者白細胞線粒體膜電位比較PSD組入院第1天白細胞線粒體膜電位低于非PSD組(P<0.05),隨訪1年時兩組白細胞線粒體膜電位均明顯升高(P<0.05),且兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 兩組白細胞線粒體膜電位比較

2.3 兩組白細胞線粒體呼吸鏈復合體活性比較PSD組入院第1天白細胞線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性低于非PSD組(P<0.05),隨訪1年時兩組白細胞線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明顯升高(P<0.05),且兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 兩組患者白細胞線粒體呼吸鏈復合體活性比較

2.4 不同嚴重程度PSD患者白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體活性比較隨著PSD嚴重程度增加,入院第1天時患者白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明顯降低(P<0.05)。結果見表4。

表4 不同嚴重程度PSD患者入院第1天時白細胞線粒體功能比較

2.5 相關性分析PSD患者HAMD評分與入院第1天白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明顯呈負相關(P<0.05)。結果見表5。

表5 PSD患者HAMD評分與入院第1天白細胞線粒體功能相關性分析

2.6 ROC曲線分析IS患者入院第1天白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性預測PSD的AUC分別為0.606、0.734、0.816、0.747和0.690(均P<0.05),具有一定診斷價值,其中線粒體膜電位和呼吸鏈復合體Ⅳ活性特異度較高,呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅲ活性敏感度較高。結果見表6和圖1。

表6 白細胞線粒體功能對PSD的預測價值分析

注:PSD:卒中后抑郁;ROC:受試者工作特征

3 討論

PSD常見于腦卒中后2年內,且高發期為腦卒中后3個月至1年,國外追蹤調查研究結果顯示腦卒中后1、3、12和24個月時PSD發生率分別為25%、31%、16%和29%[10-11]。本研究對182例IS患者治療后隨訪1年,結果顯示PSD發生率為40.11%。這與王東等[5]報道的36.4%相近。既往研究認為PSD由多種因素綜合作用所致,其發病風險與IS患者基礎健康、腦卒中病灶位置和神經功能缺損嚴重程度等密切相關,同時還受家庭和社會環境影響[12]。而本研究結果并未發現PSD患者與非PSD組患者間性別構成、年齡以及BMI等臨床指標具有統計學差異,提示PSD影響因素較為復雜,且不同地區報道可能存在差異。其原因可能與樣本選取有關,如既往研究表明隨著年齡增長,PSD發病風險明顯升高,史莉瑾等[13]以平均年齡(63.1±7.1)歲的患者為樣本進行研究顯示年齡≥70歲為PSD獨立危險因素,而本研究患者平均年齡相對較小,70歲以上患者占比較低,故而對PSD的發生未顯示出統計學影響。因此,有關PSD發生的確切影響因素尚需進一步開展多因素分析研究證實。

PSD主要病理生理機制為腦組織缺血損傷導致神經遞質通路破壞,因此不僅可造成病灶部位神經功能缺損,還可通過去甲腎上腺素(NE)和5-羥色胺(5-HT)等神經遞質分泌異常引起控制情感的腦組織損傷[14]。線粒體功能異常與IS患者腦組織損傷存在密切聯系。Andrabi等[15]研究結果顯示線粒體功能損傷可影響活性氧生成和電子傳遞鏈功能,從而在細胞凋亡中發揮重要作用。岳萌等[16]通過建立小鼠高血糖腦缺血再灌注模型進行分析顯示活性氧可能通過影響線粒體膜電位而加重腦缺血性損傷。有研究結果顯示,氧化應激是造成線粒體膜電位異常的關鍵環節,腦卒中后產生的大量氧自由基可造成膜電位降低,線粒體膜通透性增加和細胞色素C大量釋放[17]。線粒體膜電位降低可導致能量代謝障礙和氧化應激異常,甚至誘導線粒體和白細胞凋亡,加重神經功能缺損,導致PSD發生風險程度增加。本研究結果顯示,PSD組入院第1天時白細胞線粒體膜電位和呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性低于非PSD組,提示IS患者線粒體膜電位降低且呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性減退導致了線粒體能量代謝障礙和腦組織損傷,當累及額葉或海馬等部位時可造成神經元活動抑制進而發生抑郁癥。

呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅳ為電子和氫傳遞載體,其活性下降直接造成線粒體能量代謝障礙和ATP合成減少。既往研究結果顯示抑郁癥模型大鼠和臨床患者腦細胞線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均存在不同程度抑制,且以復合體Ⅰ最為顯著[18]。本研究根據HAMD量表評估PSD嚴重程度,結果顯示其中輕度29例(39.73%)、中度26例(35.62%),重度18例(24.66%),表明中、重度PSD患者占比較高;同時本研究結果顯示隨著PSD嚴重程度不斷加重,入院第1天患者白細胞線粒體膜電位以及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均呈明顯降低,且PSD患者HAMD評分與入院第1天白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均呈明顯負相關性,提示IS患者線粒體功能損害與PSD發生存在密切聯系。既往研究表明線粒體在氧化應激等因素作用下導致膜電位降低,線粒體膜通透性隨之增加,線粒體內細胞色素C(CytC)大量釋放至包漿內,啟動Caspase級聯反應,從而誘導細胞凋亡[19]。有研究認為β淀粉樣蛋白(Aβ)生成和代謝障礙導致Aβ在腦內沉積,形成Aβ斑塊并誘導神經元凋亡,該病理過程又可促進Aβ沉積,從而形成級聯放大效應,導致患者認知功能逐漸下降[20]。線粒體功能障礙可導致Aβ生成和累積增多,Aβ又可消耗血紅素基團并抑制復合物Ⅳ合成,同時神經纖維纏結等病理結構中高度磷酸化的微管相關蛋白Tau也可損害復合物Ⅰ活性,可見呼吸鏈復合體活性與認知功能損害存在相互影響的關系[21-23]。此外文獻報道顯示輔酶Q10活性下降[24]、線粒體DNA缺陷[25]以及蛋白質組結構異常[26]等也在抑郁癥發病機制中占有重要地位,但這些機制與腦卒中的關系還有待進一步研究?？傊€粒體結構和功能異常是PSD發生的重要機制,且涉及線粒體結構、分子和復合體等多個環節,為完全明確線粒體與PSD關系的具體細節,后續還需要不斷研究和探討。

目前對PSD還缺少有效預測方法。慕麗等[27]報道顯示入院時紅細胞分布寬度對PSD具有一定預測價值,但敏感度和特異度均存在不足。本研究采用IS患者入院第1 天白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性進行ROC分析,結果顯示其AUC分別為0.606、0.734、0.816、0.747和0.690,其中以呼吸鏈復合體Ⅱ臨床價值最高,其敏感度和特異度分別為84.93%和64.22%,可為PSD早期預測和干預提供參考信息,但單獨應用仍然存在不足,因此后續還需要開展研究探討其他與PSD存在密切關系的實驗室指標進行聯合預測。此外,本研究顯示線粒體膜電位的預測價值較低,其原因可能與膜電位穩定性較差,導致測量結果容易發生偏倚有關。

綜上所述,PSD患者入院第1 天白細胞線粒體膜電位及呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅳ活性均明顯降低,且與抑郁嚴重程度存在明顯負相關,可能在PSD發病和進展過程中發揮重要作用,對PSD的發生具有一定預測價值。