microRNA-31、Gas6和Axl在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

段有升，王 路，張麗娜

（新疆巴州人民醫院1.放療科2.檢驗科，新疆 庫爾勒 841000）

食管鱗狀細胞癌（ESCC）是食管癌常見病理類型之一，且占比較大。隨著人們生活方式的日益轉變以及人口老齡化趨勢的加劇，ESCC 的發病率正呈逐年攀升的趨勢[1]。由于ESCC 患者發病早期癥狀相對隱匿，從而使得大多數患者首次確診便已是中晚期，失去了治療的最佳時機，導致預后不良[2]。如何有效預測ESCC 患者的預后是廣大醫務工作者共同關注的熱點。微小RNA（miRNA）是近年來人類新發現的一類非編碼單鏈RNA[3]，在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發揮著至關重要的調控作用，可能與腫瘤的發生和進展息息相關。microRNA-31 是miRNA 家族的重要成員之一[4]，可能參與了腫瘤惡性生物學行為的調控過程。Gas6 和Axl 已被證實在多種腫瘤組織以及細胞中高表達[5]，上皮- 間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的一些轉錄因子可被Gas6/Axl 復合物激活，Gas6 與 Axl 的綁定（Gas6/Axl復合物）可能通過調控上皮- 間質轉化有關轉錄因子的活性，進一步參與腫瘤細胞侵襲、轉移等過程[6]。癌胚抗原（CEA）、鱗狀細胞癌相關抗原（SCC）、細胞角蛋白19 片段抗原21-1（CYFRA21-1）作為腫瘤預后的有效生物學監測指標，目前已被廣泛應用于臨床腫瘤預后預測中。本文主要是研究microRNA-31、Gas6 和Axl 在ESCC 中的表達及其與患者預后和CEA、SCC、CYFRA21-1 的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析新疆巴州人民醫院2017 年1 月至2017 年8 月收治的80 例ESCC 患者的病歷資料。其中男性47 例，女性33 例；年齡41 ～78 歲，平均（62.34±6.28）歲；接受文化教育年限6 ～16 年，平均（10.49±1.38）年；體質指數19 ～32 kg/m2，平均（23.15±1.22）kg/m2；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期31 例，Ⅲ～Ⅳ期49 例。入組標準：（1）受試者經病理檢查確診；（2）入組前并未接受相關治療；（3）臨床資料完整；（4）可正常交流溝通。排除標準：（1）合并其他惡性病變；（2）心、肺、腦等臟器發生重大病變；（3）存在精神障礙；（4）治療期間因故退出或失訪。所有患者或患者家屬均已簽署同意書，研究獲得醫院倫理委員會批準。無菌條件下收集癌組織及癌旁正常食管組織（距離癌組織＞3 cm），各80 例。

1.2 研究方法

（1）microRNA-31 檢測：分別于患者手術后采集癌組織以及癌旁正常組織，根據miRNA easy 迷你試劑盒說明書完成總RNA 的提取，并以紫外分光光度計完成RNA 濃度、純度的測量，光密度值A260/A280 ＞1.8 為最佳。隨后使用Prime Script miRNA cDNA 合成試劑盒完成cDNA 合成，一應操作均遵循試劑盒說明書完成。之后開展PCR 擴增，借助ABI 7500 PCR 儀完成擴增，反應體系20 μL，所有樣本重復測量3 次，以平均值作為最終結果。反應參數：50 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40 個循環。然后制作溶解曲線，參數如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃15 s。根據2-△△Ct法計算相對表達量。引物序列如下：上游：5'-TGTTTTGAGCGGGGGTCAAGAGC-3'，下 游：5'-CTCTCATTTGCTATATTCA-3'。（2）Gas6、Axl 表達檢測：檢測方式選用免疫組織化學法，首先取切片完成石蠟包埋處理，之后進行脫水、抗原修復、血清封閉，滴加鼠抗人Gas6（1:200）、Axl（1:250）以及二抗孵育觀察。依次放入梯度酒精及二甲苯。顯微鏡100 倍視野下隨機選取10 個視野。染色結果取染色強度( 0: 無染色，1: 輕度，2: 中度，3: 高度) 和染 色 范 圍( 0 為1% ～9% ; 1 為10% ～24% ; 2 為25% ～50% ; 3 為51% ～75% ; 4 為＞75% ) 乘積。兩項評分乘積≥3 為陽性表達，乘積＜3 為陰性表達。（3）血清CEA、SCC、CYFRA21-1 水平檢測：術前采集所有患者空腹靜脈血3 mL，離心處理后送檢。離心參數：半徑8 cm，速率以3500 r/min 為宜，時長選擇10 min。其中CEA 及CYFRA21-1 水平的檢測借助Elecsys2010 儀器完成，相關試劑及儀器均購自瑞士羅氏公司，檢測方式選用電發光免疫測定法。SCC水平的檢測借助美國Abbott 公司的IM x System 進行，具體操作遵循儀器及試劑盒說明書完成。（4）分組方式：對所有患者均開展5 年的隨訪觀察，隨訪方式采用門診、電話結合的方法，隨訪截止時間為2022 年10 月1 日，無失訪患者。將患者按照預后狀況的差異分作死亡組32 例及存活組48 例。死亡組32 例患者中有Ⅰ～Ⅱ期患者13 例，Ⅲ～Ⅳ期患者19 例，占比差異無統計學意義（χ2=0.079，P＞0.05）。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 microRNA-31、Gas6 和Axl 在不同食管組織中的表達對比

ESCC 組織中microRNA-31、Gas6 和Axl 的表達水平均高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表1。Gas6和Axl 在食管癌組織中呈現強陽性表達，而在正常食管組織中低表達，見圖1。

圖1 Gas6 和Axl 在食管癌組織、正常食管組織中的表達情況（SP法，40 倍）

表1 microRNA-31、Gas6 和Axl 在不同食管組織中的表達對比（± s）

表1 microRNA-31、Gas6 和Axl 在不同食管組織中的表達對比（± s）

組織 例數 microRNA-31 Gas6 Axl癌組織 80 28.37±2.41 10.49±1.23 10.78±1.14癌旁正常組織 80 13.05±1.77 2.62±0.04 2.44±0.25 t 值 45.826 57.200 63.92 P 值 0.000 0.000 0.000

2.2 microRNA-31、Gas6 和Axl 表達與ESCC患者預后的關系分析

ESCC 死亡患者microRNA-31、Gas6 和Axl 的表達水平均高于存活患者（P＜0.05），見表2。

表2 microRNA-31、Gas6 和Axl 表達與ESCC 患者預后的關系分析（± s）

表2 microRNA-31、Gas6 和Axl 表達與ESCC 患者預后的關系分析（± s）

預后 例數 microRNA-31 Gas6 Axl死亡 32 32.45±2.76 11.34±1.30 11.47±1.78存活 48 25.28±2.03 9.81±1.19 9.91±1.45 t 值 13.384 5.429 4.301 P 值 0.000 0.001 0.000

2.3 CEA、SCC、CYFRA21-1 表達與ESCC 患者預后的關系分析

ESCC 死亡患者的CEA、SCC、CYFRA21-1 表達水平分別為（14.79±1.59）ng/mL、（1.52±0.24）ng/mL、（3.92±0.15）ng/mL，均高于存活患者的（3.48±1.01）ng/mL、（0.68±0.08）ng/mL、（2.24±0.07）ng/mL（P＜0.05），見表3。

表3 CEA、SCC、CYFRA21-1 表達與ESCC 患者預后的關系分析（ng/mL，± s）

表3 CEA、SCC、CYFRA21-1 表達與ESCC 患者預后的關系分析（ng/mL，± s）

預后 例數 CEA SCC CYFRA21-1死亡 32 14.79±1.59 1.52±0.24 3.92±0.15存活 48 3.48±1.01 0.68±0.08 2.24±0.07 t 值 38.943 22.505 67.496 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 表達與CEA、SCC、CYFRA21-1 的相關性分析

ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 的表達與CEA、SCC、CYFRA21-1 表達水平均呈正相關關系（P＜0.05），見表4。

表4 ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 表達與CEA、SCC、CYFRA21-1 的相關性分析

3 討論

ESCC 具有癥狀隱匿的特點，部分患者直至疾病晚期仍無明顯癥狀表現，從而導致其臨床早期檢出率較低，預后不良[7]。臨床上亟需尋找可在病變早期特異性識別ESCC 的分子標志物，以便為相關臨床早期診斷和預后評估提供指導依據。不少研究證實，miRNA在調控腫瘤相關基因表達的同時，其自身亦可發揮促癌或抑癌基因的功能[8-9]。其中microRNA-31 在差異性腫瘤中的表達不同，如在結直腸癌以及肺癌中普遍存在高表達，而在乳腺癌及卵巢癌中存在低表達，且在腺癌和鱗癌中的表達亦明顯不同。故此，通過研究microRNA-31 在ESCC 中的表達及其與患者預后的相關性有助于相關臨床早期診斷和預后評估。有研究指出，Gas6、Axl 在血液腫瘤以及其他實體惡性病變中存在異常高表達[10-11]，而這是腫瘤預后不良的獨立危險因素。本研究結果顯示，ESCC 組織中microRNA-31、Gas6 和Axl 表達水平均高于癌旁正常組織。提示microRNA-31、Gas6 和Axl 在ESCC患者中均存在異常高表達。究其原因，microRNA-31可能通過靶向調控多種下游靶基因或（和）蛋白的表達，進一步發揮促癌基因的作用，介導了ESCC 的發生、發展過程[12]。而Gas6 和Axl 可能通過表皮生長因子受體進行相關調控，進一步促進了疾病的侵襲、轉移過程，發揮了促癌基因作用[13]。馮儒學等[14]的研究發現，microRNA-31 在晚期腫瘤患者中存在異常高表達，這為本文提供了強有力的佐證。另外，ESCC 死 亡 患 者microRNA-31、Gas6 和Axl 表達水平均高于存活患者。證實了上述三項指標表達水平和ESCC 患者的預后密切相關，即隨著其表達水平的升高，ESCC 患者預后不良的風險也會升高?？紤]其原因是，microRNA-31 的異常高表達會直接導致其靶基因出現致瘤性改變，促進腫瘤的侵襲轉移，進一步導致臨床治療難度的增加，對預后造成負面影響[15]。Gas6 和Axl 可調節腫瘤細胞的侵襲、遷移能力，從而促進病情的加劇，導致預后不良[16]。此外，ESCC 死亡患者的CEA、SCC、CYFRA21-1 表達水平均高于存活患者。這反映了隨著血清CEA、SCC 及CYFRA21-1 表達水平的升高，ESCC 患者的預后會變差。分析其原因是，上述三項血清學指標在ESCC患者中的表達水平高低受臨床分期、分化程度以及浸潤情況的影響，其中腫瘤分期晚、病灶大、浸潤程度深，會導致腫瘤組織凋亡后溶解釋放至血液中的相關標志物增多，導致預后相對較差。本文結果還顯示了ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 的表達與CEA、SCC、CYFRA21-1 表達水平均呈正相關。原因可能是microRNA-31、Gas6、Axl 的異常高表達會促進腫瘤的增殖、分化、侵襲、轉移，繼而引起血清中CEA、SCC 及CYFRA21-1 含量的增多。

綜上所述，microRNA-31、Gas6 和Axl 在ESCC中均呈異常高表達，且隨著其表達水平的升高，ESCC患者的預后會變差，聯合CEA、SCC、CYFRA21-1水平檢測可作為有效預測ESCC 患者預后的手段。本文存在一定的不足之處：如未對不同臨床分期、治療方式患者進行分組對比研究，從而可能引起研究結果的偏倚，這有待在今后的研究中予以完善。