串聯質譜法檢測苯丙氨酸和酪氨酸在新生兒苯丙酮尿癥診斷中的應用價值

劉寶峰，盧甜甜

（孝感市婦幼保健院1.檢驗科2.兒童康復科，湖北 孝感 432100）

苯丙酮尿癥是一種最為常見的遺傳代謝性疾病，以血苯丙氨酸濃度升高為主要臨床特征，主要由苯丙氨酸代謝途徑中的酶缺陷引起，所缺陷的酶包括苯丙氨酸羥化酶或其輔酶四氫生物蝶呤[1]。苯丙酮尿癥常表現為常染色體單基因隱性遺傳，是臨床最為常見的一種氨基酸代謝病。苯丙酮尿癥患兒可出現頭發由黑變黃、皮膚顏色變淺、體液（尿液、汗液）有鼠臭味等表現?；純耗挲g增大后會逐漸出現智力發育落后，且年齡與其程度成正比[2]。苯丙酮尿癥新生兒出生后，相較于健康新生兒不存在明顯差異，部分患兒僅會出現喂養困難、睡眠不安，難以將其病情與苯丙酮尿癥相聯系。加強對新生兒苯丙酮尿癥的篩查具有重要的臨床意義[3]。串聯質譜法是一種靈敏度、特異度均較高的檢測方法。早在20 世紀90 年代，就有研究者將串聯質譜法應用于新生兒遺傳疾病的篩查中。串聯質譜法應用期間，對于多種目標化合物的檢測可同時進行，可在提高多種遺傳代謝性疾病檢出率的同時，降低假陰性檢出率、假陽性檢出率，從而提高檢查結果的準確性，保障患兒及時接受治療，避免其出現較為嚴重的后遺癥[4]?；诖?，本研究主要分析串聯質譜法檢測苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）在新生兒苯丙酮尿癥診斷中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究對象為2016 年至2021 年期間于孝感市婦幼保健院行苯丙酮尿癥篩查的新生兒218 420 例，其中有初篩陽性新生兒1352 例。另選取同期于該地區出生的500 例健康新生兒作為對照。500 例健康新生兒中有男性新生兒215 例，女性新生兒285例，占比分別為43.00%、57.00% ；日齡3 ～7 d，平均日齡（4.32±0.12）d。1352 例初篩陽性新生兒中有男性新生兒668 例，女性新生兒684 例，占比分別為49.41%、50.59% ；日齡4 ～7 d，平均日齡（5.21±0.08）d。兩組的以上資料相比，P＞0.05。

1.2 診斷標準

采用干濾紙血片檢測500 例健康新生兒的Phe、Tyr 濃度后，確定檢測指標線性范圍。陽性檢測值：Phe ＞120 mol/L，Phe/Tyr ≥3.5。若 新 生 兒 檢 測結果達到陽性標準，則給予復查，結果若仍表現為Phe ＞120 mol/L，Phe/Tyr ≥3.5，可診斷為新生兒苯丙酮尿癥陽性[5]。

1.3 研究方法

根據檢測后健康新生兒的Phe 和 Tyr 濃度確定Phe 和 Tyr 的線性范圍，方法：在健康新生兒足跟處采集血樣，收集血樣采用專用濾紙，將此濾紙放到常溫下自然風干，置于收集袋中。將收集袋置于-20 攝氏度溫度下保存。在7 d 內采用串聯質譜法實施檢測，方法：取用采血濾紙制成的圓形濾紙（直徑3 mm），將其置于96 孔板中。取甲醇溶液，應用Phe 和 Tyr同位素標記后加入至孔板中。密封后室溫下離心處理，離心機轉速：700 r/min，離心處理時間45 min。靜置0.5 h 后，取80 μL 置于另一個96 孔板中檢測。檢測儀器應用美國 WATERS 公司生產的串聯質譜儀及相關試劑盒，Phe標準品、Tyr 標準品及相應質控品購于美國 PE 公司。檢測期間儀器參數設置：進樣量每次20 μL，檢測模式：多反應模式，每次檢測時間3 min[6]。

1.4 觀察指標

（1）計算Phe、Tyr 線性范圍、濃度平均回收率、變異系數（CV）。（2）計算苯丙酮尿癥陽性新生兒的Phe、Tyr 水平和Phe/Tyr。

1.5 統計學分析

本研究采用SPSS 25.0 版軟件進行統計學分析，采用ChemoView 1.0 軟件進行定量分析，以±s表示計量資料。經正態性檢驗與方差齊性檢驗后，正態分布且方差呈齊性的計量資料，兩組間比較行LSD-t檢驗，組內比較行單樣本t檢驗，偏態分布的數據用秩和檢驗；以n(%) 表示計數資料，行χ2 或Fisher檢驗；P＜0.05 表示數據差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Phe 和Tyr 線性范圍、回收率及CV

線 性 范 圍：Phe 為（26.32 ～891.12）mol/L，Tyr 為（38.96 ～265.22）mol/L。濃度平均回收率：Phe 為98.0%，Tyr 為97.3%。批內 CV：Phe 為3.9%，Tyr 為4.1%。批 間 CV ：Phe 為4.6%，Tyr 為5.7%。見表1。

表1 Phe 和 Tyr 線性范圍、回收率及 CV

2.2 經串聯質譜法檢測結果

經串聯質譜法檢測發現，1352 例初篩陽性新生兒中有陽性患兒14 例，其Phe、Tyr 水平、Phe/Tyr 見表2。

表2 苯丙酮尿癥陽性新生兒的Phe、Tyr 水平及Phe/Tyr

3 討論

苯丙酮尿癥是遺傳代謝性疾病的常見類型。據調查，在全球范圍內，苯丙酮尿癥的發病率約1/1.5 萬[7]。此病屬于常染色體隱性遺傳疾病[8]。此病患兒的肝臟中缺乏Phe 羥化酶，使其血液中Phe 及代謝產物的濃度明顯高于健康新生兒。這能夠引發腦神經損傷，使患兒在智力發育方面與同齡兒童相比明顯落后[9]。加強新生兒苯丙酮尿癥的篩查具有重要的臨床意義。研究發現，檢測新生兒血液中Phe 的含量對篩查苯丙酮尿癥具有重要臨床意義，可指導診斷及治療[10]。目前，臨床上常用的相關檢測方法包括比色法、熒光法、高效液相色譜法、串聯質譜法等。其中，以串聯質譜法最為常用。相較于其他檢測方法，將串聯質譜法應用于新生兒苯丙酮尿癥診斷中，假陽性率、假陰性率均可明顯降低，檢測耗時短，無需重復、大量采血[11]。新生兒苯丙酮尿癥確診后，應及時采取有效治療措施，目的在于降低患兒血液Phe 濃度，避免其神經系統發育受到嚴重影響[12]。采取的治療措施主要包括營養治療、藥物治療、基因治療、肝細胞抑制治療。研究顯示，可通過調節飲食控制苯丙酮尿癥病情的發展[13]。過去，臨床上常采用營養療法對苯丙酮尿癥患兒進行治療（主要采用限制飲食中Phe 攝入量的方法）。有研究指出，對苯丙酮尿癥患兒進行飲食治療，會加重患兒家庭的負擔，且治療依從性無法保證，因此臨床上多改用藥物療法治療此病。在新生兒苯丙酮尿癥藥物治療中，使用的藥物主要為沙丙蝶呤[14]。沙丙蝶呤是Phe 輔酶四氫生物蝶呤的藥物形式。其藥理作用在于提高Phe 羥化酶缺乏患兒體內Phe 羥化酶的活性。研究發現，應用沙丙蝶呤治療苯丙酮尿癥可降低患兒血液中Phe 的濃度[15]。據調查，有1/4 ～1/2 的苯丙酮尿癥患兒（缺乏Phe 羥化酶）經沙丙蝶呤治療后效果理想[16]。另有部分患兒在服藥期間即使攝取正常食物，其血液Phe 濃度的控制效果仍較為理想。在進行上述治療的同時，為了解決患兒營養物質缺乏的問題，應及時給予營養素補充治療，其中包括糖巨肽、中性氨基酸。前者是一種乳酪乳清蛋白，Phe 含量低，補充可滿足身體所需。有研究指出，為苯丙酮尿癥患者補充糖巨肽，既可以減少腸道有害菌數量，還可以使短鏈脂肪酸含量增加，且不會對腎功能造成影響。研究發現，在苯丙酮尿癥的遠期并發癥中，骨脆性增加較為常見。經補充糖巨肽的苯丙酮尿癥患者骨脆性增加的發生風險明顯降低[17]。中性氨基酸是一種復合物，包含多種人體所需氨基酸。為苯丙酮尿癥患者補充中性氨基酸可降低其血液中Phe 的含量，且不會增加其腦內Phe 的含量，從而可避免其腦功能受損[18]。本研究的結果顯示，Phe 和 Tyr 的線性范圍、回收率及CV 如下：線性范圍：Phe 為（26.32 ～891.12）mol/L，Tyr 為（38.96 ～265.22）mol/L。濃度平均回收率：Phe 為98.0%，Tyr 為97.3%。批內 CV：Phe 為3.9%，Tyr 為4.1%。批間 CV：Phe 為4.6%，Tyr 為5.7%。經串聯質譜法檢測發現，1352 例初篩陽性新生兒中有陽性患兒14 例，其Phe 水平為431.28 ～621.05 mol/L，Tyr 水平為86.35 ～156.31 mol/L，Phe/Tyr 為3.9 ～5.9（均＞3.5）。這充分證實，新生兒苯丙酮尿癥診斷中應用串聯質譜法檢測Phe、Tyr 濃度，具有線性范圍寬、濃度回收率高的優勢，臨床應用價值較高。