HAL光動力治療聯合吡柔比星對膀胱癌細胞的殺傷作用及其機制的體外實驗研究

羅婉茹 田軍 章慧平 余潔 王璐瑤 龐義軍

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤,約70%為非肌層浸潤性膀胱癌,其標準的治療方式是經尿道膀胱腫瘤電切,再輔以膀胱灌注化療藥物或卡介苗,但膀胱癌治療后的復發率仍達30%～70%[1]。有研究表明癌細胞可通過表達耐藥蛋白、增強抗凋亡能力、利用炎癥反應促進腫瘤再生、DNA修復等機制,對治療產生耐藥抵抗,從而引起腫瘤復發[2]。膀胱癌輔助治療的應用已超過半個世紀,一直沒有突破性的進展,膀胱癌術后復發成為非肌層浸潤性膀胱癌治療的一個難點。

有研究顯示光動力治療(photodynamic therapy, PDT)的細胞毒效應可破壞癌細胞的耐藥蛋白、線粒體、DNA等,能與化療、放療、靶向治療等產生協同抗腫瘤作用[3]。相關臨床研究也顯示,PDT聯合化療用于膽管癌[4]、肺癌[5]和食管癌[6]患者的治療,可提高療效且患者耐受良好,是一種有前景的腫瘤治療策略。體外研究發現化療藥物和PDT聯合能提高對膀胱癌細胞的殺傷作用[7],但其作用機制尚不明確。本研究旨在驗證六氨基乙酰丙酸(hexaminolevulinate, HAL)介導的PDT聯合吡柔比星(pirarubicin, THP)在體外對膀胱癌細胞殺傷的協同效應,并初步闡明其作用機制,為臨床治療提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料

膀胱癌細胞株T24細胞由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院泌尿外科贈予;膀胱癌細胞株RT4細胞、T24細胞完全培養液和RT4細胞完全培養液購自武漢普諾賽生物科技有限公司;THP購自Sigma-Aldrich公司;HAL由廣東精觀生物醫藥科技有限公司贈予;光動力治療儀(60 W)由蘇州精觀醫療科技有限公司贈予;CCK-8試劑購自大連美侖生物科技有限公司;酶標儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司;Hoechst/PI雙染試劑盒購自Biosharp公司;倒置熒光顯微鏡購自Olympus公司;Bcl-2、Bax基因引物購自上海生物工程有限公司;逆轉錄試劑盒購自Takara公司;2×Tap Mix試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;普通梯度PCR儀購自Thermo公司;實時熒光定量PCR儀購自Roche公司;兔抗P-gp抗體購自美國Abcam公司;鼠抗GAPDH抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自武漢谷歌生物公司;WB電泳設備、化學發光凝膠成像系統購自BIO-RAD公司;ECL顯色劑購自康為世紀生物有限公司。

二、RT4和T24細胞培養及實驗分組

將膀胱癌細胞株RT4和T24細胞用其完全培養液培養,置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。觀察細胞狀態并換液,當細胞生長至80%～90%時予以傳代。傳代培養3次后取對數生長期的細胞用于實驗,各實驗均將RT4和T24細胞分為空白對照組(Control組)、PDT組、THP組、PDT+THP組。

三、細胞增殖實驗

采用CCK-8法檢測細胞增殖情況。取對數生長的RT4和T24細胞,接種于96孔板,密度為5×103個細胞/孔,細胞生長至70%時,進行后續的藥物處理,每組設置4個復孔。Control組:加入完全培養液培養24 h,CCK-8法測定細胞毒性。PDT組:兩種細胞加入相同濃度的HAL(0、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/ml),37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,將光動力治療儀光纖固定于鐵架臺上,垂直照射培養板形成直徑為10 cm的光斑,給予450 nm波長藍光照射處理10 min,繼續避光培養24 h后加入10% CCK-8(100 μl/孔),于37 ℃條件下避光孵育1 h,使用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。THP組:兩種細胞加入不同濃度的THP(RT4:0、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/ml;T24:0、0.625、1.250、2.500、5.000 μg/ml),24 h后用PBS清洗3次,同上以CCK-8法測定細胞毒性。根據實驗結果,確定用于以下PDT與THP聯合治療時的HAL的濃度和光照時間。PDT+THP組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4細胞加入濃度為0.500 μg/ml的THP,T24細胞加入濃度為1.250 μg/ml的THP,24 h后PBS清洗3次,同上以CCK-8法測定細胞毒性。用GraphPad Prism 8.0繪制細胞生長曲線。

四、Hoechst/PI雙染法檢測細胞凋亡

取對數生長的RT4和T24細胞,接種于96孔板,密度為5×103個細胞/孔,細胞生長至70%時,Control組:加入完全培養液培養24 h;PDT組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后孵育24 h;THP組:RT4和T24細胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h;PDT+THP組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4和T24細胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h。處理完后,均加入PBS清洗3次。每孔加入5 μl Hoechst染色液和5 μl PI染色液,混勻,4 ℃孵育20 min。染色后用PBS清洗1次,在熒光顯微鏡下觀察,正常細胞為弱紅色熒光+弱藍色熒光,凋亡細胞為弱紅色熒光+強藍色熒光,壞死細胞為強紅色熒光+強藍色熒光。

五、Western blot檢測P-gp蛋白表達

取對數生長的T24和RT4細胞,接種于6孔板,細胞生長至70%時,Control組:加入完全培養液培養12 h;PDT組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后孵育12 h;THP組:RT4和T24細胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育12 h;PDT+THP組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4和T24細胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育12 h。收集各組處理后的RT4和T24細胞,PBS洗滌,加入100 μl細胞裂解液,冰上裂解30 min,15 000 rpm、4 ℃離心20 min,棄沉淀,上清液即為細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。配置10% SDS-PAGE凝膠,恒壓(上層膠90 V、30 min,下層膠120 V、60 min)電泳,恒流(300 mA、120 min)轉膜,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h及一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育2 h、ECL液顯影及成像拍照。

六、RT-qPCR檢測Bcl-2、Bax基因表達

取對數生長期的RT4和T24細胞,接種于6孔細胞培養板中,待細胞基本貼壁后,Control組:加入完全培養液培養24 h;PDT組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后孵育24 h;THP組:RT4和T24細胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h;PDT+THP組:兩種細胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4和T24細胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h。每組設置3個平行樣本。用Trizol提取細胞總RNA,參照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA;以所得cDNA為模板,制備RT-qPCR反應體系,內參為GAPDH(表1);按照2×Tap Mix試劑盒說明書操作測得CT值,采用2-ΔΔCT法計算Bax、Bcl-2相對表達量。

表1 Bax、Bcl-2及相應內參GAPDH的引物序列

七、統計學方法

使用SPSS 25.0軟件進行統計分析,實驗結果以均數±標準差表示,組間差異采用方差分析進行比較,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PDT+THP組抑制RT4和T24細胞增殖

各組細胞處理后,采用CCK-8法檢測細胞增殖情況。RT4細胞選擇THP濃度為0.500 μg/ml用于聯合治療,該劑量下RT4細胞存活率為(60.09±3.55)%(P<0.05)(圖1A);T24細胞選擇THP濃度為1.250 μg/ml用于聯合治療,該劑量下T24細胞存活率為(64.42±8.73)%(P<0.05)(圖1B)。兩種細胞均選擇HAL濃度為12.500 μg/ml用于聯合治療,該劑量下RT4細胞存活率為(52.38±2.39)%(P<0.01)(圖2A),T24細胞存活率為(65.79±6.33)%(P<0.05)(圖2B)。實驗結果顯示,PDT+THP組能夠協同抑制RT4和T24細胞的增殖,此時細胞存活率分別為(17.72±4.23)%、(27.52±6.46)%,與PDT組、THP組相比,差異均有統計學意義(均P<0.01)(圖3)。

A:不同濃度THP對RT4細胞增殖的影響;B:不同濃度THP對T24細胞增殖的影響(與0 μg/ml THP組比較 *P<0.05,**P<0.01)

A:不同濃度HAL介導的PDT對RT4細胞增殖的影響;B:不同濃度HAL介導的PDT對T24細胞增殖的影響(與0 μg/ml HAL組比較 *P<0.05,**P<0.01)

A:各組對RT4細胞增殖的影響;B:各組對T24細胞增殖的影響(與PDT組、THP組比較 **P<0.01)

二、PDT+THP組促進RT4和T24細胞凋亡

采用Hoechst/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。結果顯示,RT4細胞和T24細胞PDT+THP組PI標記紅色熒光數量均多于PDT組和THP組,表明PDT+THP能夠協同促進細胞凋亡(圖4)。

三、PDT+THP組抑制P-gp蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示,在RT4和T24細胞中,與Control組、PDT組和THP組相比,PDT+THP組顯著下調P-gp蛋白的表達,表明PDT+THP能夠協同抑制膀胱癌細胞P-gp蛋白的表達(圖5)。

A:各組對RT4細胞中P-gp蛋白表達的影響;B:各組對T24細胞中P-gp蛋白表達的影響

四、PDT+THP組對RT4和T24細胞Bcl-2、Bax基因表達的影響

RT-qPCR檢測結果顯示,在RT4和T24細胞中,PDT+THP組能夠協同降低Bcl-2基因的表達、增加Bax基因的表達,與PDT組、THP組相比,差異均有統計學意義(均P<0.01)(圖6、7)。

A:各組對T24細胞中Bcl-2基因表達的影響;B:各組對T24細胞中Bax基因表達的影響(與PDT組、THP組比較 **P<0.01)

討 論

膀胱癌經電切后輔以膀胱灌注化療,化療的同時會出現多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)現象。MDR的機制主要包括:①藥物外排轉運蛋白表達增加;②腫瘤微環境變化與癌癥干細胞調控;③表觀遺傳改變和microRNA調節基因表達;④藥物靶點改變;⑤細胞凋亡易感性降低;⑥DNA損傷修復能力增強[8]。PDT利用光敏劑在腫瘤組織中的選擇性富集,通過激光觸發光敏劑產生單態氧等活性氧分子,氧化損傷周邊的細胞器和生物分子,造成腫瘤細胞壞死、凋亡、自噬、鐵死亡,并誘發免疫反應進而殺傷腫瘤細胞,在膀胱癌治療中,能與化療[9]、放療[10]和免疫治療[11]產生協同抗腫瘤作用。

P-gp是藥物外排蛋白中的一種,其表達水平與細胞膜的通透性、細胞內藥物濃度及耐藥程度有關[12]。P-gp可將細胞內的毒性代謝產物泵出細胞,對組織細胞起保護作用,同樣P-gp亦可通過三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)提供的能量將已進入細胞內的藥物從胞內泵出胞外,從而降低細胞內抗癌藥物的濃度,使細胞毒性作用減弱或完全消失,使癌細胞產生耐藥現象。有研究表明,PDT聯合化療能特異性降低藥物外排蛋白的表達從而產生協同抗腫瘤作用[13-14]。Khdair等[15]以亞甲基藍為光敏劑介導的PDT抑制了P-gp導致的抗癌藥物的外排作用,從而增加了阿霉素在卵巢癌細胞中的細胞毒性。Huang等[16]的研究結果顯示,以苯并卟啉衍生物為光敏劑介導的PDT增加了前列腺癌細胞內伊立替康的濃度,其機制為PDT降低了ATP結合盒轉運體G2的表達,激活了細胞凋亡信號通路。Arentsen等[17]的研究表明,以二磺化四苯氯為光敏劑的PDT聯合博萊霉素在體內可誘導協同抑制T24和AY-27膀胱癌細胞株生長,結果顯示PDT聯合博萊霉素治療效果顯著高于單一處理的治療效果。這些研究均說明PDT在增強藥物治療和逆轉耐藥中的作用。本研究發現PDT聯合THP能使膀胱癌細胞P-gp表達降低,說明聯合治療可通過下調藥物外排泵P-gp的表達,改善藥物的耐藥性,使癌細胞對藥物的敏感性增加,從而增強藥物的毒性作用。

Bcl-2和Bax在腫瘤細胞凋亡中具有重要的調控作用。Bax/Bcl-2比值越高細胞越易凋亡,相反Bax/Bcl-2比值低則細胞抗凋亡能力增強。P-gp作為MDR1基因的表達產物,除了具有藥物外排泵的功能外還可能存在抗凋亡作用,過表達的P-gp可通過抑制Bax/Bcl-2比值的升高及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的活性,直接抑制細胞凋亡;也可以通過活化PI3K通路,間接抑制細胞凋亡[18]。Xu等[19]的研究表明,P-gp抑制劑維拉帕米類似物能夠促進耐阿霉素的白血病細胞凋亡。本研究發現,與PDT組和THP組相比,PDT+THP組能夠協同降低P-gp蛋白的表達,下調Bcl-2基因的表達、上調Bax基因的表達,表明PDT聯合化療能夠改善藥物耐藥性,增加膀胱癌細胞凋亡易感性。

此外,一項體外研究顯示,在小鼠的肝癌細胞中,先用PDT處理后再用阿霉素處理與先用阿霉素處理再用PDT處理比較,其對腫瘤細胞的增殖抑制率提高了20%,其原因主要是由于阿霉素產生的細胞毒性作用使細胞對光敏劑的攝取減少[20]。因此本研究采用先用PDT處理再用THP處理的方式進行實驗。

綜上所述,本研究發現HAL介導的PDT聯合THP對RT4和T24細胞具有協同殺傷作用,其機制可能與聯合治療后膀胱癌細胞的P-gp下調、Bcl-2基因表達下調以及Bax基因表達上調,從而降低了癌細胞的耐藥性和促進了癌細胞的凋亡有關。本研究未能在動物實驗中進一步證明PDT聯合THP具有協同殺傷膀胱癌細胞的作用,這部分內容有待于今后進一步完善。