辣椒不同栽培土壤/基質真菌群落結構特征分析

馬慧斐 朱海生 李永平 黃昊 康玉妹 溫慶放 薛珠政

摘 要：為對比分析辣椒不同栽培土壤/基質中真菌差異、揭示辣椒無土栽培基質中真菌群落結構特性，分別采集辣椒無土栽培根際基質（SlPlRh）、無土栽培非根際基質（SlPlNRh）、根際土壤（PlRh）、非根際土壤（PlNRh）以及非耕作土壤（NPl）作為試驗素材。利用Illumina-Seq高通量測序技術檢測5種土壤/基質中真菌多樣性及豐度，分析真菌群落結構特征。結果表明：PlNRh真菌豐度和多樣性最高，SlPlNRh最低，兩者豐度存在顯著差異，其他樣品間豐度和多樣性均無顯著差異；真菌群落組成在門分類水平PlRh、SlPlRh和SlPlNRh的組成較相似，平均相對豐度占比有差異，屬分類水平NPl、PlRh和PlNRh組成相似，SlPlRh和SlPlNRh組成相似；真菌群落聚類分析表明NPl、PlRh、PlNRh 3種土壤和SlPlRh、SlPlNRh 2種基質明顯分成兩個類群；LEfSe分析結果顯示PlRh和PlNRh兩種土壤的顯著性差異物種最多、SlPlRh最少。通過檢測辣椒種植土壤和無土栽培基質中真菌多樣性及群落組成，比較分析不同類型種植基質根際真菌微生物組的差別，初步揭示辣椒無土栽培基質真菌多樣性和群落結構特征，為今后無土栽培基質選擇、基質組分配比和改良提供科學依據。

關鍵詞：辣椒；無土栽培；基質；真菌群落結構；多樣性

中圖分類號：S 641.3 ??文獻標志碼：A ??文章編號：0253-2301（2023）01-0043-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.01.007

Analysis on the Community Structure Characteristics of Fungi inDifferent Cultivated Soils/Substrates of Pepper

MA Hui-fei， ZHU Hai-sheng， LI Yong-ping， HUANG Hao， KANG Yu-mei， WEN Qing-fang*， XUE Zhu-zheng*

（Fujian Key Laboratory of Vegetable Genetic Breeding/Crop Research Institute， Fujian Academy of Agricultural

Sciences/Fujian Research Center of Vegetable Engineering Technology， Fuzhou， Fujian 350013， China）

Abstract： In order to compare and analyze the differences of fungi in different cultivated soils/substrates of pepper and reveal the characteristics of fungal community structure in the soilless culture substrates of pepper， the rhizosphere matrix （SlPlRh） for the soilless culture of pepper， non-rhizosphere matrix for the soilless culture （SlPlNRh）， rhizosphere soil （PlRh）， non-rhizosphere soil （PlNRh） and uncultivated soil （NPl） were collected as the experimental materials. Then， the diversity and abundance of fungi in the five kinds of soils/substrates were detected by using the Illumina Seq high-throughput sequencing technology， and the structural characteristics of fungal community were analyzed. The results showed that PlNRh had the highest fungal abundance and diversity， while SlPlNRh had the lowest. And there were significant differences in the abundance between the two samples， while there were no significant differences in the abundance and diversity among other samples. The fungal community composition of PlRh， SlPlRh and SlPlNRh was similar at the phylum classification level， and the average relative abundance ratio was different. At the genus classification level， the composition of NPl， PlRh and PlNRh was similar， and the composition of SlPlRh and SlPlNRh was similar. The cluster analysis of fungal community showed that the three kinds of soil （NPl， PlRh and PlNRh） and the two kinds of substrates （SlPlRh and SlPlNRh） were obviously divided into two class groups. The lEfSe analysis showed that PlRh and PlNRh had the most species with significant difference， while SlPlRh had the fewest. By detecting the diversity and community composition of fungi in the planting soil and the soilless culture substrates of pepper， the differences of the rhizosphere fungal microbiome in different types of planting substrates were compared and analyzed. Then， the diversity and community structure characteristics of fungi in the soilless culture substrates of pepper were preliminarily revealed， which provided scientific basis for the selection of soilless culture substrates， the distribution ratio and improvement of matrix group in the future.

Key words： Pepper； Soilless culture； Substrate； Fungal community structure； Diversity

植物葉內、葉表、根內和根際這4個部位存在著對其生長發育、形態建成、抗病抗逆等影響重大的微生物群落［1-2］，其中根際微生物對植物的貢獻長期以來一直倍受重視并得到深入研究［3-4］。于峰等［5］研究表明植物可以通過特殊的根系微生物群進行定殖，進而上調磷饑餓反應基因的表達，幫助緩解磷酸鹽饑餓。相比細菌，真菌對土壤中氮素、磷素吸收和植物殘體、復雜化合物分解有著更強的作用。合理管理植物根際微生物組不僅能促進宿主營養吸收、抵抗病蟲害及適應環境脅迫，還可促進健康土壤的形成，增強土壤生態系統的服務功能［6］。

無土栽培是近幾十年發展起來的產業化作物栽培新技術，包括基質栽培、水培和霧培［7］。無土栽培突破地域和土壤環境限制，可實現立體栽培，極大地節約了耕種面積［8］，有效避免土傳病害，減少農藥使用，降低水分和肥料投入，更適合農業綠色發展方向［9］。經過幾十年的試驗和發展，我國無土栽培已經廣泛應用于農業生產和社會生活的多個方面，包括基質育苗［10-11］、蔬菜種植［12-14］、花卉栽培繁殖［15-16］、生態觀光［17］等。相比水培和氣培，使用固態基質種植對技術的要求較低、操作簡便、成本低，因此得到了更廣泛的應用［18］。而針對無土基質栽培植物根部微生物的研究還較少，本研究期望通過檢測無土栽培模式基質中根際和非根際微生物多樣性，解析無土基質與植物根系互作以及根際土壤微生物群落結構特征，為今后無土栽培基質選擇、基質組分配比和改良提供科學依據。1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗位于福建省福清市福建省星源農牧科技股份有限公司的種植基地（25°32 N，119°24 E），海拔15 m?；貙倌蟻啛釒ШＱ笮詺夂?，年平均氣溫21.1℃。主要種植辣椒，采用普通設施栽培和無土基質栽培兩種種植模式。無土栽培基質按照有機肥10%、珍珠巖5%、草炭25%和椰糠60%的比例混合均勻，再分裝到基質袋中，連接水肥一體化裝備。

1.2 試驗材料采集

于2019年9月25日采集辣椒根際土/基質（PlRh/SlPlRh）、非根際土/基質（PlNRh/SlPlNRh）和基地內非種植土壤（NPl），每個小區選取5個點采集混合樣。PlNRh/SlPlNRh：將辣椒植株拔起后抖落大塊的土壤碾碎混勻，收集備用；PlRh/SlPlRh：上述操作后粘在辣椒根系的土壤/基質用力抖在鋪好的紙上，混勻備用；NPl：采自棚內柱子下面距離地面10～15 cm的土體。上述5種處理各取3次重復，每份樣品大約5 g，立即裝入滅菌的10 mL離心管中，放入干冰中速凍，用于DNA提取。

1.3 土壤DNA提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的TGuide S96基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA。用酶標儀對提取的核酸進行濃度檢測，根據濃度進行檢測擴增，擴增后PCR產物使用濃度1.8%的瓊脂糖進行電泳檢測。

1.4 真菌多樣性測序

真菌多樣性是基于Illumina Novaseq測序平臺，利用雙末端測序（Paired-End）方法，構建小片段文庫進行測序。測序結束后使用Trimmomatic［19］（version 0.33）對原始數據進行質量過濾，然后使用Cutadapt［20］（version 1.9.1）進行引物序列的識別與去除，使用USEARCH［21］（version 10）對雙端reads進行拼接并去除嵌合體（UCHIME［22］，version 8.1），最終得到高質量的序列用于后續分析。

1.5 數據分析

借助百邁客公司云平臺系統進行真菌OTU、α多樣性、群落結構、系統進化等分析。使用SPSS數據分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 樣品測序深度評價

為確定微生物多樣性測序樣本數據是否滿足后續分析需要，對測序深度進行分析。從每個樣品中隨機抽取一定測序量數據，統計它們所代表物種數目，用抽到的序列數和代表的物種數來構建稀釋性曲線。由圖1可知，隨著測序量的增加，真菌的稀釋曲線逐漸趨于平坦，雖未達到飽和，但繼續增加測序量只會產生少量新的OTU，并不對OTU總數產生顯著影響，表明本試驗的測序數據量合理，能夠較真實地反映這5組土壤樣品的真菌群落。

2.2 不同栽培基質真菌OTU差異分析

對5組樣品的OTU數進行統計，結果共產生747個OTU，每組包含的OTU數介于454～561個，共有OTU數為266個，占總數的35.6%。其中NPI、SlPlRh、SlPlNRh、PlRh和PlNRh分別得到499、493、454、465和561個OTU。PlNRh中特有的OTU最多，為70個，占總數的9.37%；PlRh、SlPlRh和SlPlNRh中特有的OTU分別為16、19和18個，數量比較接近，平均占總數的2.37%，NPI中特有的OTU為27個，占總數的3.61%。

2.3 不同栽培基質真菌α多樣性分析

從表1可知，5種類型的土壤/基質真菌α多樣性指數Ace和Chao1表現為SlPlNRh最低，PlNRh最高，顯著性分析表明它們之間存在顯著差異，其余樣品之間則無顯著差異，說明SlPlNRh的真菌豐富度最低。推測可能因為原始基質材料中真菌數量較少，且缺少植物根際分泌物的誘導。Shannon指數和Simpson指數顯示SlPlNRh所包含的真菌多樣性最少，其次為NPI，而PlRh、PlNRh和SlPlRh處理多樣性指數差距較小，顯著性分析結果表明5組樣品之間真菌多樣性不存在顯著差異。推測SlPlNRh是幾種人工配比物質的組合，原始攜帶的真菌種類有限又缺少植物根際分泌物的誘導，所以真菌多樣性最低；NPI真菌多樣性偏低可能是因為缺乏營養，即使含有豐富的真菌種類，在豐度較低的情況下也不足以檢測到；PlNRh雖然缺少根際分泌物的誘導，但其屬于自然環境，擁有最豐富的微生物資源庫，加之耕作土壤營養豐富，適宜微生物生長，因此可檢測到最豐富的真菌種類；PlRh和SlPlRh的真菌多樣性非常接近，可能是植物根際分泌物與土壤/基質中的微生物經過復雜的互作后篩選的結果。

2.4 基質栽培和土壤栽培對真菌群落組成及相對豐度的影響

從圖3可知，PlRh、SlPlRh和SlPlNRh真菌微生物群落在門分類水平上的組成較相似，但平均相對豐度占比有差異；真菌微生物群落在門分類水平上與NPl和PlNRh差異較大。各處理中真菌類群相對豐度排名前10的有子囊菌門Ascomycota、未知分類真菌unclassified_Fungi、羅茲菌門Rozellomycota、擔子菌門Basidiomycota、被孢霉門Mortierellomycota、壺菌門Chytridiomycota、隱真菌門Aphelidiomycota、油壺菌門Olpidiomycota、球囊菌門Glomeromycota和Kickxellomycota菌門。其中，子囊菌門、未知分類真菌、羅茲菌門和擔子菌門的真菌為明顯優勢菌群，其他6個菌門的平均相對豐度較低。

屬分類水平上，各處理中真菌類群相對豐度排名前10的有未分類真菌unclassified_Fungi、青霉菌屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、隸屬于糞殼菌綱未知屬的真菌unclassified_Sordariomycetes、鐮刀菌屬Fusarium、Savoryella、隸屬于毛殼菌科未知屬的真菌unclassified_Chaetomiaceae、隸屬于子囊菌綱未知屬的真菌unclassified_Ascomycota、Wardomycopsis和假埃希氏菌屬Pseudallescheria。真菌微生物群落較明顯地分成NPl、PlRh、PlNRh和SlPlRh、SlPlNRh兩組。值得關注的是常常引起植物的根腐、莖腐、莖基腐等多種病害的鐮刀菌屬真菌在PlRh、SlPlRh和SlPlNRh中豐度更低，推測在營養充足健康的辣椒根際能夠產生抑制鐮刀菌的分泌物，SlPlNRh中的低豐度應該是由于本身基質組分攜帶鐮刀菌的數量極少。

2.5 不同栽培基質真菌群落聚類分析

使用Qiime軟件計算Unifrac距離，并基于Weighted Unifrac方法構建UPGMA樣品聚類樹，對5種土壤/基質的15個樣品真菌群落構成的相似性進行聚類分析，并將聚類結果與各樣品在門分類水平上的物種相對豐度進行整合展示（圖4）。結果表明，SlPlRh和SlPlNRh的真菌群落成員在聚類上與3種土壤樣品NPl、PlNRh和PlRh明顯分成兩個大類，3種土壤的真菌群落在聚類關系上趨同性較強。表明真核微生物種群結構構建與所處的環境物質有較大的相關性。

2.6 基質栽培和土壤栽培真菌群落組間差異性

通過LEfSe分析，可以發掘出組間具有顯著差異的Biomarker，以及顯著影響組間差異性的物種或群落［23］。不同基質和土壤中真菌微生物群落組間差異LEfSe分析柱狀圖和進化分支圖見圖5，不同土壤和基質類型對應不同的Biomarker，PlRh和PlNRh兩種種植土壤的顯著性差異物種（Biomarker）最多，應該是基于土壤這個龐大的微生物資源庫且營養充足。NPl和SlPlNRh次之，SlPlRh最少。在門分類水平上，PlNRh中含有的被孢霉門Mortierellomycota的真菌為顯著性差異物種，其他4組樣品在門分類水平上無顯著差異物種。在種分類水平上，SlPlRh中包含的青霉屬Penicillium_menonorum、Xenomyrothecium_tongaense和光滑端梗孢屬的光滑端梗霉菌Acrophialophora_levis為顯著性差異物種，SlPlNRh中包含的兩種分別隸屬于曲霉屬的真菌unclassified_Aspergillus和糞殼菌綱unclassified_Sordariomycetes的真菌為顯著性差異物種?；|中差異顯著物種對植物生長的影響還需要后續試驗來檢驗。

3 結論與討論

本研究表明，辣椒根際土壤（PlRh）非根際土壤（PlNRh），無土栽培根際基質（SlPlRh）非根際基質（SlPlNRh），及非耕作土壤（NPl）包含的真菌豐度和多樣性表現為SlPlNRh＞PlRh/SlPlRh＞NPl＞PlNRh，表明植物根系可以從原本真菌資源豐富的根際土壤中選擇性地招募部分真菌類群，也可以從原本豐富度和多樣性較低的基質（也可能是因為豐度太低未被檢測到）中發展出更多的真菌類群。群落聚類分析顯示，來自土壤和基質的真菌群落能夠較明顯地分成兩個類群，表明環境物質對土壤真菌群落構建具有積極作用。5組樣品在門、綱、目、科、屬、種分類水平上不同程度地存在差異顯著性物種，這些差異物種對植物生長、發育的影響還需要進一步驗證。

無土栽培技術從早期的實驗室研究到現在的大規模商業化生產應用，經歷了150多年，而栽培基質與不同種類植物根部的互作對植物和微生物的影響還處于探索階段。我國無土栽培起步較晚，分布較廣但不夠集約，新型無土栽培技術大多數只在小規模試驗示范，還未能形成像國外那樣成熟的栽培技術體系。國內農業整體機械化程度還不夠發達，尤其是無土栽培在機械化和自動化方面與美國、德國、日本、荷蘭等發達國家相比有較大差距。無土基質的質地與普通土壤有較大的差異，目前使用的基質大部分是用草炭、有機腐殖土、椰糠、蛭石等按照一定比例混合配置而成。陳娟等［24］通過對不同類型土壤種植辣椒前后微生物多樣性比較發現，辣椒種植會使不同類型土壤中細菌和真菌的OTU數量有所上升。本研究發現無土基質中辣椒根際真菌OTU高于非根際，說明辣椒根際分泌物在基質環境下同樣能夠誘導微生物群落增長。陳娟等［24］同時也發現真菌群落結構受到不同品種辣椒基因型因素的影響，由此推測相同配方的基質中種植不同品種作物后真菌群落結構也會有差異，而具體差異以及差異對作物的影響還需要后續試驗來驗證。

設施土壤環境由于連作、缺乏雨水淋濾等因素正在不斷惡化，無土基質栽培方式成為設施蔬菜可持續綠色發展的重要途徑。胡云等［25］在黃瓜無土栽培基質中添加生物炭發現可明顯提高多種真菌的比例，還可以增加黃瓜根際酶的活性，提升黃瓜根際速效磷、速效鉀、堿解氮、有機質含量，最終提高黃瓜產量和品質。說明合理調整、改變基質組分能夠改變植物根際微生物群落結構，改善根際酶活性，進而提高作物產量和品質。本研究對不同栽培基質真菌群落聚類分析也表明3種土壤的真菌群落在聚類關系上趨同性較強，與2種基質中的真菌群落明顯區分開來，也說明種植基質對植物根際真菌群落組成產生積極作用。

因此，基質配方開發還有很大空間，為不同作物研發不同基質也是未來需要深入研究的課題。耕地土壤微生物豐度和結構的變化是反映土壤環境質量變化的重要生物指標［26］，本研究結果也反映了植物和基質相互作用對土壤微生物的影響，因此基質中微生物豐度和群落結構變化同樣可以用來檢驗基質能否為植物提供合適的根際環境。種植后土壤微生物的多樣性、群落結構等也可成為檢驗基質是否適用的參考指標。

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（責任編輯：柯文輝）