黃芪甲苷通過DNA甲基化調節VEGFA參與急性低氧腦損傷的保護作用*

楊海霞,靳慶玲,林家靜,謝 偉,鮑牧蘭,巴德仁貴

[1. 包頭醫學院醫學技術與麻醉學院(內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室),內蒙古包頭 014040;2.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院]

低氧(Hypoxia)是高原、航天航空、潛水等常面臨的生命威脅的致病原因。腦是人體極為復雜的生命器官,大腦耗氧量約占機體總耗氧量的20 %,極容易受到缺氧的影響[1]。急性低氧通常引起腦水腫的發生,使腦組織能量供應不足,腦部能量代謝發生障礙。即使在缺氧缺血之后幸存的未成熟的神經元仍有受損的神經突生長和突觸形成[2]。更有甚者引起神經元損傷,乃至凋亡。引起各種神經退行性疾病以及一系列的神經系統癥狀。

黃芪甲苷(Astragaloside,AS-Ⅳ)是中藥黃芪根中的主要活性化合物,具有免疫調節、抗炎、抗凋亡、神經保護、血管重構等多種藥理作用[3]。有研究發現AS-Ⅳ可以上調小鼠腦中的血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表達水平來促進血管新生[4],但AS-Ⅳ的調控機制還不明確,有待進一步研究。

DNA甲基化是哺乳動物體內廣泛存在的一種表觀遺傳方式。正常水平的DNA甲基化可以維持機體內環境穩態,而當DNA甲基化水平增高或降低時則會導致神經元細胞損傷[5]。不僅如此,DNA甲基化在神經再生和重塑過程中也發揮重要作用[6]。有研究發現,在低氧條件下,腦組織內的DNA甲基化水平會發生異常升高或降低[7],導致神經損傷發生。常見的調控DNA甲基化水平的酶是DNA甲基化轉移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)、DNA甲基化轉移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)、DNA甲基化轉移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)。而相關研究表明黃芪甲苷具有神經保護的作用,那么這種保護作用是否是通過改善相關保護因子啟動子區域的甲基化水平實現的,有待研究證實。

VEGFA是一種血管內皮生長因子,可以促進血管生成和調節血管生成中的細胞增殖、遷移存活和血管通透性[8,9]。各種研究證實VEGFA對中樞和周圍神經系統有直接的保護作用[10]。缺氧可以通過缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1,HIF)調節VEGFA的表達。但是黃芪甲苷是否可以通過調控DNA甲基化調控VEGFA的表達來發揮神經保護作用?這一調控機制尚不清楚。因此,本文通過研究黃芪甲苷對急性低氧后細胞的DNMTs表達水平的調節來探究這一機制,為后續進一步研究黃芪甲苷的神經保護機制提供更多依據。

1 材料與方法

1.1主要儀器 低溫離心機(5424R,Eppendorf),恒溫搖床(MaxQ 5000恒溫冷搖床,Thermo公司),酶標儀(Multiskan FC酶標儀,Thermo公司),金屬浴(K30,杭州奧盛儀器有限公司),電泳儀(BIO-RAD公司),轉膜儀(Trans-Blo,BIO-RAD公司),實時熒光定量PCR儀(7900HT,Applied Biosystems公司),熒光倒置顯微鏡(TE2000-U,Nikon公司),二氧化碳培養箱(FORMA STERI-CYCLEi160,Thermo公司)。

1.2藥品與試劑 黃芪甲苷,購自上海麥克林生化科技有限公司,規格:100 mg,純度≥98.5 %,貨號:A800922-100 mg ;小鼠的海馬神經元細胞(HT22細胞,北京協和細胞中心);BCA濃度定量試劑盒(美國Thermo公司);抗氧化劑(美國Invitrogen公司);PVDF膜(中國Roche公司);10×TBS、吐溫20(中國利維寧公司);Trizol裂解液(美國Life technologies公司);反轉錄試劑盒、SYBR Green mix、引物(上海生工生物有限公司);DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、β-actin一抗(1∶1000稀釋,CST)、96孔板、二抗、DMEM、FBS(美國Gibco公司)。

1.3藥品的處理 稱取20 mg AS-Ⅳ溶于200 μL的DMSO中,用適量DMEM定容,混勻,配制成10 mmol/L的母液,-20 ℃保存。后續使用時按梯度稀釋1 000倍得到工作液。

1.4細胞培養、分組與給藥 將HT22細胞置于10%的胎牛血清及1 %青霉素/鏈霉素混合溶液的DMEM培養基中,在37 ℃、5 %CO2的培養箱中培養。收集對數生長期細胞,分為對照組(Control)、低氧組(Hypoxia,低氧13 h復氧6 h)、黃芪甲苷組(H+AS-Ⅳ,低氧13 h后于復氧的同時給予100 μmol/L AS-Ⅳ處理)。

1.5熒光倒置顯微鏡觀察不同分組細胞形態變化 將100 μL的細胞懸液接種于直徑50 mm的培養皿中,37 ℃、5 % CO2預培養24 h。待細胞完全貼壁后,將低氧組和黃芪甲苷組細胞置于低氧盤里低氧13 h,低氧組復氧6 h后置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態,黃芪甲苷組于復氧的同時給予100 μmol/L的黃芪甲苷處理,24 h后置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。并利用胰酶消化處理收集細胞置于-20 ℃保存以供后續實驗。

1.6Real-time PCR 向細胞沉淀中加入Trizol,按照說明書步驟利用Trizol法提取總RNA,使用利維寧公司反轉錄試劑盒將 RNA反轉錄為cDNA,-20 ℃ 保存。引物由上海生工生物有限公司合成DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、VEGFA和β-actin基因,引物的設計見表 1。

表1 Real-time 基因引物序列

1.7Western blot 檢測相關蛋白的表達水平 RIPA裂解液裂解細胞并向其中加入蛋白酶抑制劑,4 ℃/12 000 r/min離心15 min,收集上清液即為蛋白原液。BCA法檢測蛋白濃度,并向蛋白原液中加入相應比例的抗氧化劑和Lodding Buffer,金屬浴100 ℃/5 min。蛋白上樣量為10 μg,進行SDS-PAGE電泳,后轉移至PVDF膜上,5 %脫脂牛奶室溫孵育1.5 h,0.1 %的 TBST 85 r/min15 min洗3次。4 ℃過夜孵育DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、β-actin一抗(1∶1 000稀釋)?；厥找豢?0.1 %的 TBST 85 r/min15 min洗3次,分別用驢抗兔、山羊抗鼠二抗室溫孵育1.5 h,0.1 %的 TBST 85 r/min15 min洗3次。用ECL發光液浸泡,化學成像儀檢測、分析。

2 結果

2.1HT22細胞在不同狀態下形態變化 熒光倒置顯微鏡下觀察到Control組HT22細胞數量多且胞體大而亮,貼壁緊密,細胞膜邊界清晰,觸角細長,細胞與細胞之間以觸角連接。與Control組相比, Hypoxia組細胞胞體變小,整體晦暗無光,細胞數目減少,且貼壁性不好,細胞膜邊界模糊,細胞觸角變短,細胞與細胞之間聚團出現。與Hypoxia組相比, H+AS-Ⅳ組細胞有所改善,胞體稍大,細胞觸角變長,細胞數目中等,貼壁性良好,死亡細胞數目減少。見圖1。

圖1 HT22細胞不同狀態下形態變化注:A:Control組;B:Hypoxia組;C:H+AS-Ⅳ組

2.2不同處理組HT22細胞中的DNMTs在mRNA表達水平上的變化 與Control組相比,Hypoxia組HT22細胞中的DNMT1、DNMT3A mRNA表達下降(P<0.05),DNMT3B mRNA表達上升(P<0.05)。與Hypoxia組相比,H+AS-Ⅳ組DNMT1、DNMT3A mRNA表達無變化(P>0.05),DNMT3B mRNA表達下降(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同處理組HT22細胞中DNMTs在mRNA表達水平上的變化注:A:DNMT1,B:DNMT3A,C:DNMT3B;* P<0.05,** P<0.01

2.3不同處理組HT22細胞中的DNMTs在蛋白表達水平上的變化 與Control組相比,Hypoxia組HT22細胞中的DNMT1、DNMT3A蛋白表達量下降(P<0.05),DNMT3B蛋白表達上升(P<0.05)。與Hypoxia組相比,H+AS-Ⅳ組DNMT1、DNMT3A蛋白表達無變化(P>0.05),DNMT3B蛋白表達下降(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同處理組HT22細胞中DNMTs在蛋白表達水平上的變化注:A:DNMT1,B:DNMT3A,C:DNMT3B;** P<0.01

2.4不同處理組HT22細胞中的VEGFA在mRNA表達水平上的變化 與Control組相比,Hypoxia組HT22細胞中的VEGFA mRNA表達下降(P<0.05)。與Hypoxia組相比,H+AS-Ⅳ組VEGFA mRNA表達上升(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同處理組HT22細胞中VEGFA在mRNA表達水平上的變化注:** P<0.01

3 討論

氧氣的存在對于大腦的正常工作十分重要,因為它是能量產生必備因素,腦組織對能量的需求是極大的[11]。當缺氧時,不僅會引起腦組織水腫,活性氧增多,長期缺氧也會導致有缺陷的血管生成,而這種血管會限制血流量,使向大腦輸送的營養物質和氧氣減少,導致神經系統殘疾[12]。當機體缺氧時,機體激活HIF轉錄家族,其中HIF-1在調節血管內皮生長因子中起著重要作用。HIF和其他缺氧調節因子包括表皮生長因子 (Epidermal growth factor,EGF),血小板衍生生長因子 (Platelet derived growth factor,PDGF) 協調VEGF的表達,進而調節VEGF驅動的信號[13]。在本文結果中,低氧13 h,復氧6 h之后,HT22細胞中的VEGFA表達水平下降,可能是因為缺氧時間已經超過了神經元細胞的代償能力。在神經元失代償的情況下,已經對神經元細胞造成了不可逆的損傷。大量文獻證明缺氧會引起許多基因不同程度的甲基化。Lain等人[14]通過RNA-Seq發現,在缺氧后四天細胞狀態有所恢復,并且大部分基因啟動子區域的DNA甲基化減少,相關基因表達上調。與之相對應的是,在急性缺氧后細胞的神經元樹突長度顯著低于對照組,許多基因啟動子區域的甲基化水平升高,并且隨著缺氧時間的增加而增加[15]。Xu等人[16]研究發現,對PCl2細胞給予氧糖剝奪刺激時,引起神經元細胞中的miR-422a積累,而引起這一結果是因為Lnc-D63785 m6A甲基化。同樣有研究證實,抑制m6A甲基化可以保護神經元免受缺血再灌注損傷[16]

黃芪甲苷作為一種中藥成分,被人們廣泛應用治療各種疾病。大量文獻證明它可以促進神經突觸再生,增加血腦屏障通透性[17]。它不僅具有神經保護作用,而且在心血管、腎、肺、抗腫瘤等方面都發揮重要作用[18,19]。Li等人[20]通過研究證實黃芪甲苷不僅可以消除缺血腦中NK細胞介導的對缺氧葡萄糖剝奪神經元的溶細胞殺傷,還通過STAT3抑制腦缺血后NK細胞的浸潤和激活,發揮對急性缺血性腦損傷的保護作用。VEGF不僅能促進血管再生,還可以在體內體外廣泛地促進神經發生,神經元遷移和存活。Khaibullina等人[21]研究發現VEGF可以增加神經突數目、長度和大小。VEGF可以獨立于神經膠質直接影響神經元。而且許多體內實驗也證實了VEGF在調節神經祖細胞增殖、存活、遷移、軸突/樹突狀結構和突觸功能中的直接和重要作用。本研究發現,黃芪甲苷處理后VEGFA表達量上升,這表明,黃芪甲苷可能是通過上調VEGFA的表達來保護小鼠的海馬神經元細胞。DNA甲基化是一種經過充分研究的表觀遺傳變化,DNA高甲基化導致轉錄抑制,而低甲基化導致轉錄激活[22]。Li等人[23]研究發現低氧3 h和6 h STAT3和VEGF啟動子區域的甲基化水平明顯低于常氧組,與之相應的是STAT3和VEGF的表達水平高于常氧組。盡管結果與本研究有所出入,但是都表明低氧確實會引起VEGF啟動子區域的甲基化水平發生改變。不過低氧時間的長短不同也可能導致基因的表達水平發生變化。

本研究發現,低氧時DNMT3B表達升高,而黃芪甲苷處理后DNMT3B表達下降,與之對應的是VEGFA在低氧后表達下降,黃芪甲苷處理后表達上升。結果提示,黃芪甲苷的作用機制有可能是通過下調VEGFA啟動子區域的甲基化水平來實現的。但這一保護機制仍然十分復雜,需要今后進一步探究驗證。