人參皂苷Rb1對MPTP誘導的帕金森病模型小鼠神經保護作用的初探*

代玉晶,孫建芳,賈建新,楊占君,霍東升

(1.包頭醫學院2020級研究生,內蒙古包頭 014040;2.包頭醫學院)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見的中樞神經系統退行性疾病之一,多好發于中老年人,其發病率僅次于阿爾茨海默病[1]。PD的主要臨床癥狀表現為靜止性震顫、動作遲緩、肌強直和肌力下降等運動學癥狀及抑郁、嗅覺、睡眠和感覺障礙等非運動學癥狀[2]。在病理上表現為中腦黑質致密部多巴胺能神經元漸進性丟失和路易小體(α-Synuclein)的形成以及紋狀體區多巴胺(Dopamine,DA)遞質降低、DA與乙酰膽堿遞質失衡等生物化學水平改變[3]。目前,PD的治療多以針對多巴胺能和膽堿能神經元的藥物為主,主要有擬多巴胺化合物、多巴胺受體激動劑、單胺氧化酶-B抑制劑、兒茶酚-O-甲基轉移酶抑制劑以及抗膽堿能藥物等,它們大多通過增加腦內多巴胺水平或模擬多巴胺效應,改善患者癥狀,提高患者的日常生活自理能力。而這些藥物必須長期服用,且存在較大的不良反應,長期服用可導致嚴重后果(如停藥后癥狀加劇)。因此,開發有效且不良反應較小的治療藥物對于PD來說具有更重要的臨床價值。

人參(PawaxgiwsewgC.A.Mey.)為五加科人參屬的一種,是多年生草本植物。藥用人參為植物人參的根部,人參的用藥歷史十分悠久,早在《神農本草經》就有記載:“人參,味甘微寒,主補五臟,安精神,定魂魄,止驚擇,除邪氣,明目,開心益智?！盤D在中醫范疇屬“肝風”、“內風”、“震顫”、“顫證”等,《黃帝內經》稱震顫為“掉”和“振掉”。人參用以治療PD古代典籍已有記載,如《本草衍義》和《丹溪先生心法》中“筋急拘攣語遲脈弦加薏苡仁,若筋急加人參”,提示人參可能具有緩解PD癥狀的作用。人參的主要活性成分有人參皂苷、生物堿、多糖、葡糖苷和酚酸等,研究表明,人參皂苷對PD具有較好的治療作用[4,5],但主要集中在GsRg和GsRe,而有關GsRb1的報道較少。Zhang等[6]研究報道GsRb1可以改善PD模型小鼠的運動障礙,防止DA能神經元死亡。本研究通過腹膜腔注射 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制備PD模型,探討GsRb1對PD模型小鼠運動行為的影響和作用,擬尋求其最佳保護劑量,為GsRb1對PD保護作用的可能機制研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物 選用8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,體質量范圍為20～24 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,批號:SCXK(京)2019-0010。造模前先適應性飼養一周,飼養環境為室溫23～25 ℃,標準濕度55 %～60 %,光照和黑暗各12 h,自由飲水、進食,分籠飼養。

1.2試劑和儀器 GsRb1購自北京索萊寶科技有限公司(批號:129k022),用生理鹽水溶解,配成4 mg/mL的溶液備用;MPTP購自美國Sigma公司(批號:M0896),用生理鹽水配置成3 mg/ml備用;疲勞轉棒儀(型號:XR1514)購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.3方法

1.3.1動物分組與處理 C57BL/6小鼠隨機分為對照組(control)、模型組(MPTP)、GsRb1低劑量組(Rb1-L)、中劑量組(Rb1-M)和高劑量組(Rb1-H),共5組,每組各10只,參考文獻設計給藥方案[7,8]。對照組小鼠-3～0 d,6～11 d,每次按10 ml/kg的劑量腹膜腔注射生理鹽水,1～5 d,每天腹膜腔注射生理鹽水2次;MPTP模型組小鼠-3～0 d,6～11 d,每天腹膜腔注射生理鹽水1次,1～5 d,每天腹膜腔注射生理鹽水和MPTP各1次;MPTP+Rb1各劑量組小鼠-3～11 d,每天將GsRb1分別以10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg腹膜腔注射1次,1～5 d每天腹腔注射MPTP 1次。所有的PD模型小鼠,均連續5 d腹膜腔注射30 mg/kg的MPTP。MPTP和Rb1的注射時間間隔需超過12 h(MPTP在8:00 am給藥,Rb1在8:00 pm給藥),在第12 d進行小鼠行為學檢測實驗。動物實驗按照包頭醫學院動物實驗指導原則進行,動物實驗經包頭醫學院動物實驗倫理委員會批準。

1.3.2行為學檢測 (1)轉棒實驗:小鼠的運動協調性通過轉棒實驗進行評估。實驗前將小鼠置于疲勞儀的旋轉棒上,給予30 s適應環境。啟動疲勞儀,使轉桿轉速達到25 r/min,紅外裝置在300 s內記錄小鼠從轉棒上落下時在轉棒上移動的時間,作為小鼠轉棒實驗的下落潛伏期。即小鼠第一次從轉棒上掉下來的時間。每只小鼠檢測3次下落潛伏期,每次間隔至少30 min,取平均值為小鼠下落潛伏期。(2)爬桿實驗:將直徑2 cm的小球,固定于直徑1 cm、高50 cm的鐵桿頂端,全部用紗布包裹以防止小鼠打滑。測試時將小鼠頭向下放置于桿的頂端,記錄小鼠爬到桿底部的時間,以雙前肢接觸到平臺為準。連續檢測5次取平均值,每次間隔1 min。(3)懸掛實驗:采用自制懸掛實驗箱,將被測小鼠兩前爪置于一根直徑為1.5 mm,30 cm長,25 cm高的金屬桿上,然后放開小鼠,記錄其抓握情況。 評分標準:兩后爪均可抓住金屬桿,記4分;一只后爪可抓住金屬桿,記3分,兩只后爪均不能抓住金屬桿,記2分;若出現后爪反復抓取金屬桿,間斷可抓住現象,記1分。

1.3.3統計學方法 實驗數據采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析,計量資料以均數±標準差表示。多樣本均數比較采用單因素方差分析 ( One way ANOVA) ,兩兩比較采用LSD法檢驗,樣本服從正態分布,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1轉棒實驗 與對照組相比,MPTP組小鼠掉落潛伏期顯著降低(P<0.01);與MPTP組比較,GsRb1低劑量組掉落潛伏期升高,但不具有統計學意義(P>0.05),GsRb1中劑量組和高劑量組掉落潛伏期均升高,均具有統計學意義(P<0.05);各劑量組之間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 GsRb1對PD模型小鼠轉棒掉落潛伏期的影響注:與空白對照組比較,** P<0.01;與MPTP組比較,#P<0.05

2.2爬桿實驗 與對照組比較,MPTP組小鼠爬桿時間顯著升高(P<0.01);與MPTP組相比,GsRb1中劑量組爬桿時間明顯降低(P<0.01),低劑量組和高劑量組爬桿時間均顯著降低(P<0.05)。給藥組之間比較,GsRb1中劑量組較低劑量組爬桿時間明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 GsRb1對PD模型小鼠爬桿時間的影響注:與空白對照組比較,**P<0.01;與MPTP組比較,##P<0.01,#P<0.05;與GsRb1低劑量組比較,&P<0.05

2.3懸掛實驗 與對照組比較,MPTP組小鼠懸掛實驗評分顯著降低(P<0.01);與MPTP組比較,中、高劑量組小鼠評分明顯升高(P<0.05);各劑量組之間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 GsRb1對PD模型小鼠懸掛評分的影響注:與空白對照組比較,**P<0.01;與MPTP組比較,# P<0.05

3 討論

PD是一種好發于中老年人的慢性進行性神經退行性疾病,由于中腦黑質致密部多巴胺能神經元退變,導致紋狀體多巴胺丟失,一方面直接解除對蒼白球內側部神經元的抑制,另一方面間接增強丘腦底核神經元活性,增加蒼白球內側部介導的丘腦抑制,最終導致出現運動遲緩、肢體僵直。MPTP目前已被廣泛應用于PD模型的制備,其可穿過血腦屏障,在星形膠質細胞中被單胺氧化酶代謝后轉化為MPP+,后者通過多巴胺轉運體蛋白攝入聚集在多巴胺能神經元的線粒體中,抑制線粒體復合物I的活性,引起神經元變性壞死,這與PD的病理改變較為類似,可以較好地模擬PD的病理生理學變化和運動障礙癥狀。

GsRb1具有多種藥理活性,尤其在中樞神經系統、心血管系統、免疫系統以及抗腫瘤等方面研究廣泛。在中樞神經系統方面,GsRb1具有中樞抑制和安定作用,并具有改善學習記憶能力、抗腦缺血損傷等神經保護作用。課題組在前期研究中使用H2O2處理PC12細胞,發現PC12細胞存活率下降,而GsRb1可以有效抑制上述作用,發揮一定的細胞保護作用[9]。眾所周知,α-synuclein異常聚集是PD重要發病機制之一。Ardah等[10]證實GsRb1可以抑制α-synuclein的纖維化和毒性作用,不僅可以分解纖維化的α-synuclein及其聚合,而且可以穩定可溶性的沒有毒性的α-synuclein低聚物,從而使其被蛋白激酶K消化。有報道發現GsRb1可通過上調谷氨酸轉運體GLT-1,改善MPTP誘導PD模型小鼠的運動障礙,防止DA能神經元死亡[6]。GsRb1對PD模型小鼠神經保護作用的量效關系未見報道,據此本實驗通過三種動物行為學評價方法,包括協調性、運動能力、肌力等,來觀察GsRb1對PD模型小鼠運動障礙的改善效果,尋求GsRb1的有效保護劑量。本實驗結果顯示,給予MPTP后,小鼠的行為學表現為掉落潛伏期顯著降低,爬桿時間明顯升高,懸掛實驗評分顯著降低,說明MPTP發揮其毒性作用,導致小鼠肌力、運動能力下降,運動協調性差。給予GsRb1預處理后,小鼠掉落潛伏期明顯升高,尤其是中、高劑量組與MPTP組差異有統計學意義,結果提示小鼠的運動協調性隨藥物劑量增加而持續改善。在反映小鼠肌力情況的兩個實驗中發現,中、高劑量組小鼠懸掛實驗評分顯著升高,而低劑量組卻無顯著性差異;在爬桿實驗中,GsRb1三個劑量組與MPTP組均存在顯著性差異,且以中劑量組效果最佳;結果也提示,小鼠肌力的改善與GsRb1的劑量相關,可能中劑量組的效果較好。

綜上所述,GsRb1能夠改善MPTP誘導PD模型小鼠的運動能力、肌力及協調性,給予20 mg/kg劑量GsRb1預處理即可能對抗MPTP的毒性作用,起到較好的神經保護效果。