姜黃素對高糖誘導人腎小管上皮細胞線粒體自噬的影響*

常 江,王 穎,李永妍,賴連英,楊時旭,李玉潔

(1.海南醫學院第一附屬醫院肝膽外科,海南?？?570102;2.海南醫學院第一附屬醫院全科醫學科;3.海南醫學院)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥,在其發展過程中如不予干預,可進展至終末期腎臟病。DN發病機制比較復雜,早期臨床防治難度大。自噬功能障礙與DN發病有密切關系,線粒體自噬可以特異性選擇并清除受損或老化的線粒體,減少細胞內ROS,從而維持機體自身穩態。姜黃素是諸多中藥的天然藥物成分,為酸性多酚類物質,有極其廣泛的藥理作用,如抗凝、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗炎等。目前已發現姜黃素對腎臟病變具有一定的治療作用,且不良反應小、使用安全,已成為研究的熱點。但是,姜黃素對DN的保護作用及機制并不明確。本研究觀察姜黃素對高糖環境下人腎小管上皮HK-2細胞線粒體自噬以及氧化應激的影響,為進一步研究DN的有效中藥治療提供重要的理論來源和依據。

1 對象和方法

1.1材料與試劑 HK-2細胞購自美國ATCC (Manassas,USA細胞庫);低糖 DMEM 培養基(美國Gibco公司);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京Solarbio公司);兔抗人Pink1多克隆抗體、兔抗人Parkin多克隆抗體、兔抗人β-actin 多克隆抗體、鼠抗人Beclin-1多克隆抗體、兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗體(美國Abcam公司);姜黃素(美國MCE公司);D-葡萄糖(美國Sigma公司);線粒體膜電位(JC-1)檢測試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司);ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所);CCK-8檢測試劑盒(日本同仁公司)。

1.2姜黃素對HK-2細胞安全有效濃度的篩選 采用細胞計數試劑盒(Cell countin kit-8,CCK-8)檢測HK-2細胞活力,探討姜黃素的最佳藥物濃度。對照組細胞予DMEM培養基,該培養基葡萄糖(glucose)濃度為5.5 mmol/L;高糖培養基的配制首先用DMEM培養基溶解D-葡萄糖,過濾后配成母液,然后按一定比例加入DMEM培養基中,使其葡萄糖終濃度為30 mmol/L。用0.25 %胰蛋白酶進行細胞消化后,在96孔板中以104～105個細胞/孔密度接種細胞,隨機分為7組:對照組(5.5 mmol/L glucose),10 μmol/L姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+10 μmol/L Cur),20 μmol/L姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+20μmol/L Cur),40 μmol/L姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+40μmol/L Cur),60 μmol/L姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+60 μmol/L Cur),80 μmol/L姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+80 μmol/L Cur),100 μmol/L姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+100 μmol/L Cur),處理細胞48 h。根據說明書要求,將細胞進一步在新鮮培養基中培養48 h,然后將10μL CCK-8溶液分別加入到每孔培養基中。將培養板放置在37 ℃、5 %CO2環境中培養1 h。酶標儀檢測450 nm處的吸光度值,選擇姜黃素最佳濃度用于后續實驗。

1.3HK-2細胞培養及實驗分組 HK-2細胞接種于DMEM培養基中培養,培養箱條件5 % CO2、37 ℃,隔日換液,待細胞生長至80 %時進行傳代。將實驗HK-2細胞隨機分為4組:HK-2細胞接種于5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液中培養,記為對照組(5.5 mmol/L glucose);對照組加入10 μmol/L姜黃素共培養,記為姜黃素組(5.5 mmol/L glucose +10 μmol/L Cur);HK-2細胞接種于30 mmol/L葡萄糖的培養基中培養,記為高糖組(30 mmol/L glucose);高糖組加入10 μmol/L姜黃素共培養,記為姜黃素高糖組(30 mmol/L glucose+10 μmol/L Cur)。干預48 h后進行各項實驗。

1.4蛋白質印跡法檢測LC3B、beclin1、Pink1、Parkin蛋白表達 使用RIPA裂解緩沖液溶解HK-2細胞,離心(13 000 r/min、15 min、4 ℃),蛋白質濃度測定按照二辛可酸(Bicinchoninic acid ,BCA)蛋白定量檢測試劑盒說明書操作。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離蛋白,將分離的蛋白凝膠轉移到聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene flouride,PVDF),膜被封閉在5 %脫脂奶粉中,37 ℃溫箱孵化1 h,4 ℃封閉一抗過夜。本研究使用的主要抗體為:anti-LC3B(1∶1 000,Abcam);anti-beclin1(1∶1 000,Abcam);anti-pink1(1∶10 000,Abcam);anti-parkin(1∶10 000,Abcam);anti-β-actin(1∶1 000,Abcam)。TBST洗滌3次后,用二抗(1∶1 000)室溫封閉2 h,利用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.5線粒體膜電位的檢測 按線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)說明書進行操作,對于6孔板的1個孔,吸除培養液,用PBS洗滌細胞1次,加入1 mL細胞培養液,37 ℃細胞培養箱中用JC-1染色工作液1 mL標記 HK-2細胞20 min,之后吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次,加入2 mL細胞培養液,培養液中含有血清和酚紅,應用激光共聚焦顯微鏡觀察其熒光圖像。激發光設置為525 nm,發射光設置為590 nm。線粒體膜電位較高時,產生紅色熒光,線粒體膜電位較低時,產生綠色熒光。通過JC-1從熒光顏色的轉變檢測線粒體膜電位的變化。

1.6細胞內ROS的檢測 根據產品說明書,用活性氧測定試劑盒對活性氧生成進行評價。不同分組HK-2細胞在含有2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)且最終濃度5 μmol/L的不同培養基中培養48 h。在37 ℃、5 %的二氧化碳培養箱孵育30 min,1 %多聚甲醛固定,在4 ℃冰箱里放置10 min。細胞內非特異性酯酶去乙?；?DCFH-DA被ROS氧化生成熒光化合物2,7 -二氯熒光素(2,7-Dichlorodihydrofluorescein ,DCF)。采用流式細胞術檢測DCF熒光強度,采用FlowJo軟件進行分析。

2 結果

2.1CCK-8實驗結果 通過CCK-8實驗篩選姜黃素最佳藥物濃度。與對照組相比,姜黃素高糖組細胞活性減低(P<0.01);高糖環境下不同濃度姜黃素組間比較,10 μmol/L姜黃素組細胞活性最高(P<0.01),篩選姜黃素最佳藥物濃度為10 μmol/L。見圖1。

圖1 CCK-8實驗選擇姜黃素最佳藥物濃度注: *為P<0.01,***為P<0.001

2.2各組 HK-2 細胞western blot檢測結果 與對照組比較,姜黃素組各項指標無明顯改變(P>0.05);與姜黃素組比較,高糖組LC3B、beclin1、Pink1、Parkin蛋白表達降低(P<0.01);與高糖組比較,姜黃素高糖組LC3B、beclin1、Pink1、Parkin蛋白表達升高(P<0.01)。見圖2。

2.3各組 HK-2 細胞線粒體膜電位檢測結果 與對照組比較,姜黃素組熒光強度無明顯改變(P>0.05);與姜黃素組比較,高糖組細胞相對熒光強度比值降低(P<0.01);與高糖組比較,姜黃素高糖組細胞相對熒光強度比值升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 JC-1熒光探針檢測各組HK-2細胞線粒體膜電位水平注: **為P<0.01, ***為P<0.001

2.4各組 HK-2 細胞 ROS 檢測結果 與對照組比較,姜黃素組ROS水平無明顯改變(P>0.05);與姜黃素組比較,高糖組ROS水平升高(P<0.01);與高糖組比較,姜黃素高糖組ROS水平降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組HK-2細胞ROS水平檢測注: ***為P<0.001

3 討論

DN是糖尿病的微血管并發癥之一,是導致終末期腎臟病的主要原因,在全球范圍內其致殘率及病死率均高[1]。而DN的發病機制比較復雜,目前研究仍未完全闡明,致使其臨床防治難度較大[2]。因此,探索天然藥物成分緩解和改善糖尿病腎病已成為目前研究的重點,對提高DN患者的生活質量,延長其生存時間及減少患者的支出具有非常重要的作用。

DN的早期腎臟病變可見腎小球超濾過和肥大,腎小管損傷也是DN的早期變化和特征,與其進展關系密切,阻斷腎小管上皮細胞受損可能更接近于DN治療的源頭[3]。DN狀態下腎小管損傷的主要病理改變為腎小管萎縮、腎小管上皮細胞凋亡、周圍炎癥細胞浸潤及轉分化等。其主要分子機制為高糖及糖代謝產物、蛋白尿、氧化應激等誘導細胞內信號通路異常激活,ROS產生增多,釋放出許多細胞因子,引起腎小管損傷[4]。線粒體是ROS產生的主要細胞器,高糖所致的線粒體ROS過多是腎小管損傷的核心[5]。自噬功能障礙與DN發病密切相關,自噬有助于把損傷和老化的細胞結構進行生理性移除,同時促進細胞存活,維持組織的內穩態[6]。線粒體自噬屬于巨自噬,其機制是通過自噬及時清除受損或不需要的線粒體,并且與溶酶體融合,進而降解損傷線粒體,維持機體ROS平衡[7]。自噬效應蛋白Beclin-1和微管相關輕鏈蛋白LC3均是重要的自噬標記蛋白,且LC3B的含量與自噬的程度成正比。因此本研究通過western blot檢測Beclin-1和LC3B在正常及高糖環境下的蛋白表達,觀察姜黃素對其影響。線粒體自噬主要與Pink1/Parkin通路、BNIP3和NIX受體介導有關[8]。有研究證明,Pink1/Parkin通路激活,可改善DN足細胞線粒體自噬,減輕足細胞損傷[9, 10]。DN狀態下,Pink1/Parkin通路在腎小管上皮細胞的表達變化仍未明確,因此,本研究進一步檢測Pink1、Parkin蛋白表達,以觀察高糖誘導的腎小管上皮細胞線粒體自噬相關通路,探討姜黃素的可能作用機制。

姜黃素是天然存在的一種生物活性多酚,具有抗氧化、清除氧自由基、抗炎、抗腫瘤等多方面藥理作用[11],因其具有強大的抗炎能力,被應用于各種炎癥性疾病的治療,如糖尿病、阿爾茲海默病等[12]。有研究發現,姜黃素可改善DN大鼠腎臟細胞和尿液單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic,MCP-1)的表達,抵抗局部炎癥擴散和發展,改善大鼠腎功能[13]。短期口服姜黃素可通過上調核受體轉錄因子2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf-2)系統和抗炎作用進而降低糖尿病患者的蛋白尿[14]。姜黃素可增強LC3B和線粒體標志物VDAC1的共定位,改善腦缺血-再灌注誘導的線粒體自噬[15]。但是,姜黃素是否可影響高糖誘導的HK-2細胞線粒體自噬,以及可能機制未明確,仍有待研究。

在本研究中,我們以HK-2細胞為研究對象,應用高糖刺激,加用姜黃素干預。CCK-8實驗用來選擇姜黃素最佳藥物濃度,10 μmol/L姜黃素可顯著提高高糖環境下HK-2細胞活性,故后續實驗選擇10 μmol/L姜黃素作為干預劑量。結果發現,高糖環境可抑制HK-2細胞線粒體自噬,細胞內ROS產生增加。姜黃素對正常糖濃度的HK-2細胞無明顯影響,但可改善高糖環境下HK-2細胞線粒體自噬,緩解氧化應激,具體表現為高糖環境下HK-2細胞加用姜黃素后,Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、beclin1蛋白表達顯著升高,JC-1檢測細胞相對熒光強度比值升高,ROS水平減低。姜黃素對糖尿病腎病的保護機制可能為增加HK-2細胞線粒體自噬活性,激活Pink1/Parkin通路,同時對抗氧化應激。