miR-103及其靶基因Cav1.2在低氧預適應提升小鼠學習記憶中的表達*

翁清明,王 蒙, 謝 偉,3, 謝雅彬,3

(1.包頭醫學院內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室,內蒙古包頭 014040;2.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院;3.包頭醫學院醫學技術與麻醉學院神經科學研究所)

低氧預適應(hypoxic preconditioning, HPC)為機體組織細胞的一種“獲得性耐受”,是指生物體、器官、組織或細胞暴露于非損傷性、重復性輕度或中度缺氧條件下,使機體對后續更為嚴重的缺氧產生耐受性[1]。HPC是機體的一種內源性神經保護機制,其具體分子機制還不明確,但是其很可能通過表觀遺傳學發揮作用,而MicroRNA是表觀遺傳學重要組成部分。MicroRNA(miRNA)是一種小的、高度保守的內源性非編碼單鏈RNA,通過與靶mRNA的3’-非翻譯區結合,負調節mRNA表達,并在轉錄后基因表達調控中發揮作用[2]。miR-103可以通過靶向阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)細胞模型中的前列腺素內過氧化物合酶2,促進神經突生長和抑制細胞凋亡,而且miR-103的表達與阿爾茨海默病患者的癡呆嚴重程度呈負相關,這些研究揭示了miR-103作為AD 疾病風險和疾病進展的生物標志物的潛能[3-4],并可能通過調節下游靶基因影響認知功能。此外,Cav1.2是L型電壓門控鈣通道主要的組成部分,在哺乳動物大腦中廣泛表達,CACNA1C基因是Cav1.2的主要編碼基因[5]。研究發現,在海馬和新皮質中CACNA1C基因失活的小鼠表現出海馬依賴的空間記憶嚴重受損[6]。而且Cav1.2還參與海馬長時程增強(Long-term potentiation, LTP)的形成。即miR-103可能通過調節Cav1.2影響學習記憶。在本研究中,首先通過對HPC處理后表達產生變化并可能與學習記憶有關的miRNA進行篩選,確定miR-103下游靶基因Cav1.2。而鑒于Cav1.2又與學習記憶有關,因此進一步探究miR-103和Cav1.2在低氧預適應改善學習記憶能力中的表達變化,以闡明miR-103調控Cav1.2在低氧預適應內源性神經保護中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 ICR雄性小鼠,6～8周、體重18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010]。本研究經包頭醫學院批準,小鼠在動物房進行飼養以及后續的解剖,并按照中國實驗動物相關規定及原則給予人道處理。

1.2儀器與試劑 超聲波破碎儀(Thermo Fisher Scientific,FB50),離心機(Eppendorf,Centrifuge 5424 R),恒溫搖床(國華企業集團有限公司,SHZ-82),酶標儀(Thermo Fisher Scientific,Multiskan FC),電泳儀(BIO-RAD,PowerPacTM Basic),化學發光成像儀(上海天能科技有限公司,Tanon-5800),超凈工作臺(Thermo Fisher Scientific,1300IIA2),實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,ABI7500),BCA濃度定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific,VJ312126),抗氧化劑(Invitrogen,2481173),組織裂解液(Beyotime,P0013C),PVDF膜(Roche,03010040001),TBST(VETEC,WXBD7901V),microRNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司,B518811],miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司,B532451],SYBR Green mix(康為世紀生物科技有限公司,CW0955)等。

1.3低氧預適應模型的建立 小鼠稱重,選取質量范圍在18～22 g的小鼠進行分組:對照組(Control)、低氧組(Hypoxia)、低氧預適應組(HPC)。構建低氧模型,首先將小鼠放入150 mL的透明玻璃的廣口瓶中,塞緊橡膠塞,用計時器立刻計時并觀察小鼠的呼吸及生理狀態。當小鼠達到低氧非致死狀態時,即小鼠出現大口喘氣并且仰式臥位,同時身體出現痙攣以及大小便失禁的情況,迅速拔下橡膠塞,快速取出小鼠并實施搶救,記下其耐受時間,記實驗小鼠為1次低氧小鼠。重復上述步驟,共4次,即為低氧預適應模型小鼠。只進行1次低氧的小鼠為低氧組。未進行低氧的小鼠為對照組。

1.4Morris水迷宮實驗 使用Morris水迷宮測試小鼠的空間學習和記憶能力。對照組(Control)、低氧組(Hypoxia)、低氧預適應組(HPC)每組各10只小鼠。首先將小鼠分別放入水池中60 s,進行自由游泳以適應環境。第2 d將平臺放入SW象限,將小鼠面朝池壁放入水中進行訓練,每個象限各1次,每 d 1次,共6 d。當小鼠在1 min內找到平臺并在平臺上停留5 s即為訓練成功,如1 min內找不到平臺的小鼠,將由實驗員用木棍引導小鼠到平臺上停留10 s,時間記為1 min,即為小鼠的潛伏期。反復上述實驗,共6 d。第7 d將水池中的跳臺撤去,任選一個象限放入小鼠(所有小鼠入水點相同),記錄穿梭平臺區域次數以及目標象限停留時間百分比。

1.5實時熒光定量PCR 使用SanPrep柱式microRNA抽提試劑盒提取小鼠海馬的總microRNA,并使用miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒反轉錄為cDNA。RT-qPCR使用SYBR Green PCR Master Mix 和 Real-Time PCR系統進行。用2-ΔΔCt方法計算相對RNA水平,歸一化為U6。

1.6Western Blot 電泳 剝離各組小鼠海馬于冰上融化后,加入300 μL的RIPA裂解液和3 μL蛋白酶抑制劑后超聲破碎,將樣品放入4 ℃低溫離心機中12 000 rpm離心15 min,將上清液轉移到新的EP管中,使用BCA試劑盒確定蛋白濃度。電泳上樣質量為20 μg,5 %的濃縮膠使用19 mA,6 %分離膠使用29 mA;使用快速轉膜液400 mA轉膜25 min。使用5 %的脫脂牛奶封閉90 min,TBST清洗3次,每次10 min。4 ℃過夜孵育一抗(1∶1 000);TBST清洗3次,每次15 min;使用山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(1∶3 000)35 r/min孵育90 min;TBST清洗3次,每次15 min。使用ECL超敏發光液檢測蛋白條帶。

1.7熒光素酶報告實驗 將m-CACNA1C-3’UTR的野生型(Wild Type)和突變型(Mutant)結合位點分別亞克隆到pSI-Check2載體中,構建m-CACNA1C-Wt/Mut。然后,將m-CACNA1C-3’UTR-Wt或m-CACNA1C-3’UTR-Mut與NC模擬物或miR-103-3p模擬物共轉染293T細胞,用雙熒光素酶測定系統評估熒光素酶活性。

2 結果

2.1低氧耐受時間變化 小鼠隨著低氧次數的增加,后一次低氧耐受時間比前一次的低氧耐受時間增加明顯并且有統計學意義(P<0.05)。此結果符合低氧預適應可增加小鼠對低氧的耐受性,表明低氧預適應模型構建成功。見圖1。

圖1 低氧次數對小鼠耐受時間的影響注:與前一次比,****P<0.000 1,**P<0.01;n=18

2.2HPC對小鼠空間學習記憶的影響 通過水迷宮來檢測HPC對小鼠空間學習記憶的影響。經過6 d的定位巡航實驗,與Control組相比,HPC組小鼠的潛伏期時間趨勢在1到6 d明顯降低(P<0.05);Hypoxia組與Control組相比潛伏期時間沒有明顯變化(P>0.05)。經訓練后的空間探索實驗,小鼠穿梭目標象限平臺(SW象限)次數及目標象限停留時間百分比(SW象限)判斷小鼠的記憶能力。與Control組相比,HPC組小鼠在目標象限時間的百分比增加(P<0.05) ,小鼠平臺穿越次數明顯增加(P<0.05)。結果表明,HPC可以改善小鼠的空間學習記憶能力。見圖2。

圖2 HPC對小鼠空間學習記憶的影響注:A.潛伏期時間變化,B.各組目標象限百分比,C.各組穿越平臺次數;與Control組比較,*P<0.05

2.3HPC條件下miRNA的變化 對HPC處理后的小鼠海馬進行QPCR檢測。與Control組相比,HPC組小鼠海馬組織中miR-103、 miR-137和miR-153在HPC處理后1 d表達明顯下調(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-103、miR-137、miR-153表達變化(n=4)注:A.miR-103表達變化,B.miR-137表達變化,C.miR-153表達變化;****P<0.000 1

2.4miR-103-3p通過與3’UTR結合靶向Cav1.2 通過對miR-103-3p下游靶基因進行篩選,發現Cav1.2與學習記憶有關,而CACNA1C基因是Cav1.2的主要編碼基因。因此,進一步通過熒光素酶報告實驗驗證了miR-103-3p對Cav1.2的靶向調控,測定了miR-103-3p與Cav1.2之間的結合序列。miR-103-3p模擬物明顯降低了CACNA1C-WT載體的熒光素酶活性,但CACNA1C-Mut載體中未觀察到顯著變化。見圖4。

圖4 miR-103-3p通過與3’UTR結合來靶向Cav1.2注:A.miR-103-3p與Cav1.2 3’UTR之間的結合序列,B.雙熒光素酶報告基因檢測mmu-miR-103-3p與m-CACNA1C-3’UTR之間的結合關系;****P<0.000 1

2.5小鼠海馬中Cav1.2表達變化 與Control組相比,HPC組小鼠海馬組織中Cav1.2蛋白在第2 d表達升高(P<0.01),其與HPC組小鼠海馬組織中miR-103在第1 d表達降低相互驗證。見圖5。

圖5 不同處理組小鼠海馬中Cav1.2的蛋白表達變化(n=4)

3 討論

HPC是指通過預先暴露于亞致死性的條件下,增加對隨后更加嚴重的缺氧的耐受能力,它是一種內源性保護機制,而提高學習記憶是這種保護機制重要表現形式之一。Zhang等人[7]研究發現間歇性低氧可增強幼齡小鼠的空間認知能力。此外,Shao等人[8]也發現低氧預處理可以提高小鼠空間認知能力。通過水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力,本研究發現HPC組的小鼠學習記憶能力有明顯的提升,與Shao等人的研究結果一致,不過其機制有待進一步發掘。

HPC的保護作用非常明確,其很可能通過表觀遺傳學發揮作用。Liu等人[9]研究發現來自HPC處理的間充質干細胞釋放的富含miR-216a-5p的外泌體可以通過抑制TLR4的活性,將小膠質細胞從M1表型轉變為M2表型,從而調節TLR4/NF-κB/PI3K/AKT信號級聯,從而促進小鼠脊髓損傷后的功能恢復。由此可知,HPC可以通過miRNA發揮保護作用。在HPC條件下表達變化的眾多miRNA中篩選確定了miR-103、miR-137、miR-153。因為,Yan等人[10]發現在miR-137基因缺失的小鼠中,空間學習和記憶受損,這可能與Ezh2基因表達增加有關。miR-137還與鉛誘導的海馬體依賴性空間記憶障礙有關[11]。You等人[12]研究發現,miR-153的靶點是瘦素受體及其調控的JAK-STAT信號通路,過表達miR-153抑制LEPR和JAK-STAT信號通路,導致BDNF表達增加,海馬神經元增殖能力增加,促進長期記憶的形成,減輕孤獨癥癥狀。此外,miR-103除了可能對AD患者的認知能力有影響外還與術后認知功能障礙有關,Wu等人[13]研究發現右美托咪定通過調節miR-103a-3p/VAMP1軸,減輕了小膠質細胞的激活和相關的炎癥反應,在術后認知功能障礙中具有保護作用。 我們使用TargetScan在線預測工具對與Cav1.2的主要編碼基因CACNA1C的3’UTR區域結合的miRNA進行預測,發現miR-103的5’端第2-7個堿基與CACNA1C基因3’UTR互補配對,且第一個堿基位置是腺嘌呤,為標準結合,有預測出的結合位點。miR-137和miR-153與CACNA1C基因的3’UTR為非標準結合,沒有預測出來的結合位點。因此,本研究優先選擇miR-103進行雙熒光素酶報告基因檢測,確定miR-103對Cav1.2之間是否存在直接調控關系。盡管miR-137和miR-153的表達也下調,也可能存在對Cav1.2的調控,但畢竟沒有預測出明確的結合位點。因此,我們優先選擇miR-103進行后續的實驗。此外,Chen等人[14]發現生物鐘基因BMAL1可誘導miR-103的表達,進而在轉錄后水平調控大鼠腦動脈Cav1.2通道的晝夜節律調節。Favereaux等人[15]也發現在疼痛反應過程中miR-103可以雙向整合調控Cav1.2鈣通道。同時,miR-103在模擬微重力條件下可以通過抑制Cav1.2的表達來抑制成骨細胞增殖[16]。

Cav1.2是小鼠海馬中最主要的L型鈣通道,由CACNA1C基因編碼,是一種高壓激活(HVA),持久(L型)和二氫吡啶(DHP)敏感鈣通道,其主要分布于心血管系統、神經系統和內分泌腺并在其中發揮重要的生理病理功能。例如,CACNA1C基因的功能獲得性突變導致運動行為、社交互動以及焦慮增加和保存行為的潛在改變[17]。當細胞內鈣通過鈣通道充分升高時,大量的信號通路被激活。例如,組成性存在的蛋白激酶的磷酸化導致突觸可塑性的增加和LTP的形成,其最初通過磷酸化膜受體(如AMPA受體),隨后在數小時內通過激活基因轉錄和蛋白合成。Moosmang等人[18]發現,海馬中缺少Cav1.2的小鼠顯示出NMDAR非依賴性LTP的選擇性丟失,海馬依賴性空間記憶嚴重受損。由此可知,Cav1.2在海馬依賴的學習記憶中扮演重要角色。

綜上所述,HPC可以提高小鼠的低氧耐受能力,并發揮神經保護作用。因為miRNA是表觀遺傳學基因轉錄后調控的重要組成部分,故猜測其可能是通過表觀遺傳學發揮作用。因此,本研究通過對HPC處理后小鼠海馬表達變化的miRNA進行篩選確定了miR-103,并分析出下游靶基因可能是Cav1.2,又通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證了miR-103調控Cav1.2,而Cav1.2參與認知功能?？傊?HPC可能下調miR-103表達,而下調的miR-103又能上調其下游靶基因Cav1.2,并最終提升小鼠低氧耐受并改善學習記憶能力。