減重手術調控胃饑餓素對肥胖大鼠攝食量和體質量的影響*

張澤宇,李瑞斌,王 瑋,萬智恒

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院2019級研究生,內蒙古包頭 014040;2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院)

肥胖定義為異常脂肪堆積,被認為是能夠嚴重影響人類健康的慢性疾病。世界衛生組織預測21世紀中葉,世界人口的2/3即近20億人將發展為超重,另外1/3人口發展為肥胖[1]。傳統觀念認為肥胖癥可通過限制飲食、適當規律的運動等方式得到控制。然而這些干預措施的效果與患者個人的習慣相關,若患者難以堅持則易造成反彈;內科治療雖然能有效降低體質量并且短期內取得一定的效果,但減重的效果難以得到保障。減重手術起源于20世紀中葉,在60年間不斷發展進步,目前成為了病態肥胖和肥胖型2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎最有效的治療方法之一[2]。Roux-en-Y胃旁路術(RYGB)和立式袖狀胃切除術(VSG)是減重手術中最常見的兩種術式,已有相關臨床研究表明,接受減重手術的患者在進行減重術后的2年、6年和12年分別實現了35 %、28 %和26.9 %的總體質量減輕,其中2型糖尿病患者在2年、6年和12年的體質量減輕程度分別為75 %、62 %和51 %[3]。雖然減重手術效果較好,但其降低攝食量和體質量的分子機制仍有待探索。

胃饑餓素(Ghrelin)是一個28個氨基酸肽類激素,主要在胃組織中表達,可通過血-腦屏障進入下丘腦,具有促進攝食的作用。Ghrelin對食欲和體質量的刺激作用通過下丘腦弓狀核和腹內側核中的生長因子促分泌素受體介導產生。mTOR可通過自噬調節能量代謝。研究表明,mTOR信號通路表達失調可與癌癥、肥胖、糖尿病和神經退行性疾病等多種疾病相關[4]。mTOR信號通路活性與病理性肥胖相關,且相關研究發現mTOR/p70s6k基因敲除的小鼠免受飲食誘導肥胖的影響[5]。近年研究發現,食欲控制因子CB1受體和Ghrlein在胃底內分泌細胞共表達。mTOR通路可協調胃大麻素系統和Ghrelin的相互作用,CB1受體阻斷劑可減少食物攝入,增加胃中mTOR/p70S6k的活性,使Ghrelin的水平降低[6]。大量文獻表明,進餐后Ghrelin高表達可以引起食欲下降,且減重術后Ghrelin基因發生變化,體質量成功下降。深入研究Ghrelin與肥胖之間的相關性,發現減重手術對其調控機制,這在對肥胖的治療中至關重要。本實驗旨在觀察減重手術對肥胖大鼠攝食量、體質量的影響,以及是否與術后Ghreiln、mTOR/p70s6k通路變化有關,為肥胖的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1.1動物及分組 5周齡、體質量160～180 g的雄性SPF級SD大鼠90只購自北京斯貝福。隨機分成普通飼料組(15只)與高脂飼料組(75只)。普通飼料組采用普通維持飼料飼養作對照組,高脂飼料組采用45 %高脂飼料飼養[7],兩組飼料均足量,保證自由攝食水。記錄構建模型期間大鼠的攝食量及體質量變化,記錄每天攝食量,每周稱量1次體質量。經過5周高脂飼料喂養,高脂飼料組中體質量高于普通飼料組20 %以上的大鼠視為肥胖模型構建成功。將構建成功的肥胖大鼠隨機分成肥胖模型組、假手術組、減重手術組,7只/組。術后1周,假手術組與手術組大鼠由營養液(安素)過渡到攝入同先前的高脂飼料后,自由攝食水。

1.1.2主要試劑與儀器 Ghrelin(PA5-18409)、mTOR(AHO1232p70)、p70s6k(A300-510A-T)、BCA蛋白定量試劑盒(23227)購于美國Thermo Fisher公司;p-mTOR(59.Ser 2448):(sc-293133)購于美國Santa Cruz公司;p-p70s6k(Ser427)(12524)購于美國SAB公司;β-actin(bs-0061R)購于北京bioss公司;二抗IgG山羊抗兔(P03S02)、山羊抗小鼠(P03S01)購于北京金普萊公司;RIPA裂解液(BL504A)。垂直電泳槽、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司,化學發光儀天能5800購自上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1手術 造模成功的手術組肥胖大鼠術前禁食水12 h,采用10 %水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后,備皮逐層開腹后暴露出胃組織,找到肝胃韌帶、脾胃韌帶并離斷后,沿胃大彎一側分批離斷結扎網膜血管弓及胃短血管,分別于胃大彎幽門、his角上下兩點,沿胃小彎走形各夾閉一把無損傷血管鉗,沿血管鉗離斷并移除約70 %～80 %大彎側胃組織,包含全部胃底。切緣消毒后用無菌縫線(5-0)間斷縫合切緣,徹底止血。將殘留胃組織回置原位。逐層關閉腹膜、肌肉、皮膚,完成袖狀胃手術操作。假手術組與減重手術組進行相同的圍手術期處理,逐層開腹后進行腹腔探查,從食管下端開始檢查到結腸的全部腸段,離斷胃周血管并暴露小腸,以濕紗布覆蓋,假手術組時間、關腹步驟同手術組,切口長度與手術組大致相近。

1.2.2血脂測定 術后4周,大鼠腹腔注射10 %水合氯醛溶液麻醉后,將大鼠仰臥固定于手術臺上,備皮消毒后沿腹正中線開腹,用一次性采血針和真空管于腹主動脈取血。離心取血清置入全自動生化分析儀檢測三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)含量。

1.2.3樣品采集 術后4周,將大鼠麻醉處死后取胃組織,并儲存于-80 ℃。

1.2.4Western-blot 在胃組織中加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑,超聲裂解提取總蛋白,BCA試劑盒對蛋白濃度進行定量。采用20 μg上樣量,用8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓80 V隨后400 mA轉膜過夜,將蛋白轉移至PVDF膜上。用5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,然后分別與β-actin、Ghrelin、mTOR、p70s6k、p-mTOR、p-p70s6k(1∶2 000)一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,10 min/次,然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)常溫孵育1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,ECL發光。以β-actin作為內源性對照。

2 結果

2.1減重術后體質量和攝食量的變化 測量記錄術后1-4周各組大鼠攝食量及體質量變化,結果可見,與肥胖模型組和假手術組大鼠相比,手術組肥胖大鼠減重術后第2周起體質量下降,第4周降至最低,攝食量也有顯著降低。見表1。

表1 術后攝食量和體質量的變化

2.2減重術后的血脂結果 假手術組與肥胖模型組大鼠血清三酰甘油和總膽固醇含量高于對照組和減重手術組(P<0.05),見圖1。

圖1 血清三酰甘油和總膽固醇含量注:control代表對照組,sham代表假手術組,model代表肥胖模型組,operation代表減重手術組。*P<0.05,**P<0.01

2.3Western-blot檢測Ghrelin、mTOR及下游基因p70s6k在胃組織中表達水平 肥胖模型組大鼠胃組織中p-mTOR和p-p70s6k蛋白表達增加(P<0.05);減重術后,胃組織中Ghrelin、p-mTOR和p-p70s6k蛋白表達降低(P<0.05)。各組間mTOR和p70s6k蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明,減重手術可下調Ghrelin蛋白的表達。見圖2。

圖2 大鼠胃組織中Ghrelin、p70s6k、p-p70s6k、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平(n=3)注:A為Western-blot檢測Ghrelin、p70s6k、p-p70s6k、mTOR、p-mTOR蛋白條帶圖,B為蛋白條帶的統計分析圖;#為與肥胖模型組相比P<0.05,*為與假手術組相比P<0.05

3 討論

隨著人民生活水平的提高,肥胖這一“富態”疾病呈逐年增長的趨勢。大量研究表明,肥胖與飲食習慣、遺傳、缺乏運動、生活環境、精神壓力、藥物等因素密切相關。本研究通過構建食源性肥胖大鼠模擬不良飲食習慣引起的肥胖,觀察到大鼠在同樣足量的食物和水的環境中,在飼養時明顯偏好于高脂飼料,且攝食量較單純普通飼料組增加。肥胖大鼠行減重手術后,在身體痊愈后恢復至正常飲食,攝食量明顯下降,術后體質量顯著下降,說明減重手術可有效減輕肥胖大鼠的體質量,能夠影響其攝食量。

近年臨床研究已證實減重手術可有效降低患者的體脂,下調患者術后血脂水平,改善患者術前的非酒精性脂肪肝病,控制術前的高血壓,對2型糖尿病有一定的控制和治療效果[8]。本實驗結果發現,減重術后肥胖大鼠血脂水平下降,數值上接近對照組。

Ghrelin作用于下丘腦,可產生食欲、增加能量儲存、促進脂肪沉積,且主要在胃組織中表達。目前有研究發現,通過袖狀胃切除術可顯著降低血漿Ghrelin,降低患者術后對于高脂高熱量食物的欲望[9-10]。臨床病例報告顯示,減重術后空腹Ghrelin水平下降,1年后不再下降[11]。動物研究結果顯示,減重術后大鼠體內Ghrelin水平下降,且與術后的前3個月體質量下降呈正相關[12]。本研究也表明,減重手術可導致大鼠胃組織中Ghrelin表達量降低,血清三酰甘油和總膽固醇含量下降,因此減重手術實現血脂、攝食量和體質量降低可能通過調控Ghrelin表達實現。

mTOR信號通路可調節控制下丘腦能量平衡[13],該信號通路與病理性肥胖有關,且相關研究發現mTOR/p70s6k基因敲除的小鼠免受飲食誘導肥胖的影響[14]。近年研究發現胃內由mTOR信號通路協調胃大麻素系統和生長素釋放肽相互作用完成的食物攝入調節機制。飲食肥胖型小鼠的Ghrelin和大麻素調節參與大麻素系統-迷走神經的傳入飽腹感信號通路的受體和分解酶被破壞,這可能導致肥胖動物迷走神經的敏感性發生變化[15]。研究表明,減重手術可造成mTOR/p70s6k信號通路的變化[16]。本研究結果表明,減重手術可導致mTOR/p70S6k通路抑制,Ghrelin下調。

綜上所述,減重術后大鼠體質量減輕、食欲下降的可能原因是mTOR/p70s6k通路相關蛋白表達下調,從而降低Ghrelin的表達,該結果為減重術后體質量下降增加理論依據,對臨床減重手術的應用具有指導意義。