池塘和稻田養殖環境下克氏原螯蝦腸道菌群結構特征及其影響因素

殷文健 何 俊 李佳佳 陳煥根 張憲中*

（1．無錫市水產畜牧技術推廣中心，江蘇 無錫 214125；2．江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；3．江蘇省漁業技術推廣中心，江蘇 南京 210036）

腸道微生物是機體中復雜且多樣的生物系統，在宿主與腸道微生物長期共同進化的過程中，兩者形成了相互協作、互利共生的關系[1]。正常生理狀況下，腸道微生物處于動態平衡狀態，且這種平衡與宿主的吸收代謝和免疫調節密切相關[2-3]。腸道微生物失衡會引起腸道疾病，危害宿主健康，影響養殖的經濟效益。水產動物的腸道微生態系統極易受養殖環境的影響。研究表明，水溫會影響水產動物腸道微生物的組成[4]，水體溫度為18 ℃時，羅非魚腸道微生物數量顯著高于26 ℃[5-6]。Yang 等[7]報道，在稻田養殖模式中，泥鰍腸道菌群的多樣性秋季比夏季高，并且鄰單胞菌屬只出現在夏季。夏季稻田養殖模式下的泥鰍腸道菌群中的厚壁細菌、乳酸菌屬和鏈球菌屬明顯高于池塘養殖模式[7]，表明養殖環境直接影響水產動物的腸道微生物組成。

池塘和稻田養殖是目前克氏原螯蝦主要的養殖模式，兩種養殖模式下克氏原螯蝦的腸道優勢菌群相同，但是占比存在較大差異[8]。環境微生物會影響水產動物的腸道微生物的組成與微生態建立，養殖水體和底泥是水產動物養殖環境中重要部分。目前，不同養殖模式下動物腸道菌群的差異是否與養殖環境中微生物組成具有相關性仍需要進一步研究。因此，本研究在比較池塘和稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群組成差異的基礎上，深入研究養殖環境（水體和底泥）微生物菌群對克氏原螯蝦腸道菌群的影響，為池塘與稻田養殖模式下小龍蝦的養殖管理和調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

在江蘇省無錫市選擇3 口（1～2 hm2/口，水深1～1.5 m）克氏原螯蝦養殖池塘，3塊（4～6 hm2/塊，水深1～1.5 m）水稻-克氏原螯蝦綜合種養田塊。2021 年3 月25 日至4 月10 日，在池塘和稻田中陸續放養4～5 g/只克氏原螯蝦（250～300 kg/hm2），于2021 年7 月8 日采集池塘和稻田內克氏原螯蝦（25～32 g/只）、表層底泥和底層水樣品，用于微生物菌群組成分析。養殖所用飼料為小龍蝦配合顆粒餌料（蘇州海大飼料有限公司），主要原料為魚粉、豆粕、菜粕、蝦殼粉、面粉、肉粉、磷酸二氫鈣、氯化鈉、復合維生素、微量元素等，營養水平為粗蛋白37%、粗纖維8%、粗灰分9%、水分10%、鈣2%。

試驗期間每天早晚投喂2 次餌料，保證3 h 內吃完。養殖期間，保證水源充足，根據水質和天氣變化加注新水。試驗期 90 d。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 樣品采集

使用地籠從每個池塘和稻田中各捕撈克氏原螯蝦30 只，去除附肢，使用75%酒精浸泡15 min，無菌水漂洗4次（每次5 min），使用滅菌的濕棉球將蝦尾部擦拭干凈，拽拉尾部末端扯出整個腸道，使用鑷子將腸道內容物擠至滅菌的5 mL離心管中，每個池塘和稻田中所有克氏原螯蝦腸道內容物混合，于-80 °C 凍存[9]。利用采泥器采集池塘和稻田表層（15 cm）底泥樣品，每個池塘和稻田采集中間和4個角落共5個點，混合，放入滅菌離心管中，于-80 °C 凍存。利用無菌玻璃瓶采集池塘和稻田的水體樣品，每個池塘和稻田采集5 個點（100 mL/點），混合后低溫高速離心，收集沉淀，于-80 °C凍存。

1.2.2 生長性能

試驗開始和結束統計克氏原螯蝦初始體重和終末體重，計算增重率和餌料系數。

1.2.3 DNA提取與高通量測序

參照Zoetendal等[10]的方法提取樣品總DNA。樣品經過渦旋處理后在低溫條件下10 000 g離心15 min，將獲得的沉淀轉移至鋯珠管中，加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖溶液對樣品進行研磨處理，利用DNA提取液（北京索萊寶科技有限公司）對總基因組DNA進行抽提。樣品經過經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）測定DNA 純度和含量。利用細菌16S rRNA 基因V4 區通用引物（515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R：GGACT ACHVGGGTWTCTAAT）[11]進行PCR 擴增、產物純化、建庫。利用Illumina HiSeq 2500 平臺（Illumina）對檢測合格的文庫進行300×2 bp 測序。本研究中PCR 產物純化、建庫和測序在華大基因（BGI）完成，測序原始數據上傳至NCBI（PRJNA757836）。

1.2.4 高通量測序結果分析

利用軟件Cutadapt（3.4）[12]截掉測序數據的引物和接頭，去除窗口平均質量低于20的末端堿基、含N的序列、片段長度小于225 bp的序列以及低復雜度的序列[13]。上述質量過濾后的序列導入Qiime2（2020.11）[14]進行嵌合體去除與雙端拼接，所用軟件為Dada2（1.20.0）[15]，前端序列保留長度230 bp，后端序列保留長度200 bp，其余參數為軟件默認值。使用Vsearch（2.16.0）[16]對上述序列進行97%聚類，聚類方法為Open-reference，以Silva（123）數據庫作為參考序列，其余參數設置為默認值。使用Mafft（7.4）[17]對代表性序列進行系統進化分析，并通過Qiime2 進行微生物菌群結構的Alpha 和Beta多樣性分析和微生物物種注釋（Silva 123）。

1.3 數據統計與分析

數據采用Excel 2020 進行初步整理，SPSS 20.0 進行相關性分析，利用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗比較差異，使用R 軟件包進行微生物Spearman 相關性分析，使用GraphPad Prism 處理分析過的數據并作圖。置信區間為95%，結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同養殖模式對克氏原螯蝦生長性能的影響（見表1）

表1 不同養殖模式對克氏原螯蝦生長性能的影響

由表1可知，不同養殖環境對克氏原螯蝦的初均重、末均重、增重率和餌料系數影響不顯著（P＞0.05）。

2.2 池塘與稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物多樣性的影響

池塘和稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物菌群Observed_features 稀釋曲線見圖1?？耸显r腸道、水體和底泥樣品的高通量測序數據經過濾后，分別有62 197、56 902、57 657 條/樣序列用于后續數據分析。

圖1 池塘和稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物菌群Observed_features稀釋曲線

由圖1 可知，蝦腸道、水和底泥微生物高通量測序深度足夠，研究數據具有代表性。

不同養殖模式對腸道、水和底泥微生物Alpha多樣性指數的影響見表2。由表2可知，與池塘養殖相比，稻田養殖蝦腸道菌群Faith_pd 和Oberserved_features 指數具有下降趨勢，水體微生物Pielou_evenness 和Shannon_entropy 指數均顯著降低（P＜0.05），Faith_pd 指數具有下降趨勢；底泥多樣性指數無顯著變化（P＞0.05）。

表2 不同養殖模式對腸道、水和底泥微生物Alpha多樣性指數的影響

不同養殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物Beta多樣性分析見圖2。由圖2可知，養殖模式能夠明顯影響蝦腸道與水體微生物菌群結構，而對底泥微生物影響較小。

圖2 不同養殖模式下克氏原螯蝦腸道、水和底泥微生物Beta多樣性分析

2.3 不同養殖模式對克氏原螯蝦腸道菌群結構的影響（見圖3）

圖3 不同養殖模式對克氏原螯蝦腸道菌群組成的影響

由圖3 可知，克氏原螯蝦腸道內優勢菌門（相對豐度＞1%）有Proteobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia、Actinobacteria 等13 種；池塘蝦腸道內相對豐度最高的菌門為Proteobacteria（19.98%），稻田蝦腸道內相對豐度最高的菌門為Firmicutes（16.10%）。蝦腸道內優勢菌屬（相對豐度＞0.5%） 有Candidatus Bacilloplasma、UnculturedChthoniobacterales、UnculturedRsaHF231等41 個；池塘蝦腸道內相對豐度最高的屬為UnculturedChthoniobacterales（9.45%），稻田蝦腸道內相對豐度最高的屬為Candidatus Bacilloplasma（9.44%）。

不同養殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群差異分析見表3。由表3可知，與池塘養殖相比，門水平上，稻田蝦腸道內Fusobacteria 的相對豐度顯著增加（P＜0.05），Actinobacteria和Cyanobacteria的相對豐度有增加的趨勢，Verrucomicrobia 的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。Acidobacteria 和Proteobacteria 的相對豐度有降低的趨勢。與池塘養殖相比，在屬水平上，稻田蝦腸道內Planktothrix、UnculturedActinobacteria、Methylocaldum、Luteolibacter、 Mycobacterium、UnculturedRhizobiales、Desulfocapsa、Synechococcus、Uncultured PeM15 的相對豐度顯著增加（P＜0.05）；UnculturedChthoniobacterales、UnculturedChthoniobacterales、UnculturedAnaerolineaceae、UnculturedMycoplasmataceae的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。

表3 不同養殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群差異分析

2.4 池塘與稻田水體微生物結構分析（見圖4、表4）

圖4 池塘與稻田水體微生物組成

表4 池塘與稻田水體微生物差異分析

由圖4 可知，水體微生物優勢菌門（相對豐度＞1%）有Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria 等10 種，其中池塘水體Proteobacteria豐度最高（34.17%），而稻田水體中豐度最高的菌門為Cyanobacteria（41.69%）。水體微生物優勢菌屬（相對豐度＞0.5%） 有UnculturedCyanobacteria、 UnculturedSporichthyaceae、 UnculturedComamonadaceae等38 個，其中池塘水體UnculturedSporichthyaceae豐度最高（12.01%），而稻田水體中豐度最高的菌屬為UnculturedCyanobacteria（21.34%）。

由表4 可知，在門水平上，與池塘相比，稻田水體Fusobacteria 門相對豐度顯著增加 （P＜0.05），Verrucomicrobia 相對豐度顯著降低 （P＜0.05），Actinobacteria 和Cyanobacteria 相對豐度有增加的趨勢，Acidobacteria、Proteobacteria相對豐度有降低的趨勢。在屬水平上， 與池塘相比， 稻田水體UnculturedCyanobacteria等13 個屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），UnculturedSporichthyaceae等18 個屬相對豐度顯著降低（P＜0.05），UnculturedComamonadaceae屬相對豐度有降低的趨勢。

2.5 池塘與稻田底泥微生物結構分析（見圖5、表5）

圖5 池塘與稻田底泥微生物組成

表5 池塘與稻田底泥微生物差異分析

由圖5 可知，底泥優勢（相對豐度＞1%）菌門有Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria 等11 種；相對豐度最高的門均為Proteobacteria（36.79%、31.23%）。底泥優勢 （ 相對豐度＞0.5%） 菌屬有UnculturedAnaerolineaceae、 UnculturedAcidobacteria、 UnculturedXanthomonadales等38 個；相對豐度最高的屬均為UnculturedAnaerolineaceae（9.41%、10.00%）。

由表5 可知，與池塘相比，稻田底泥Firmicutes 門和Marmoricola屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），UnculturedNitrospinaceae和UnculturedDesulfobacteraceae屬相對豐度顯著降低（P＜0.05），Actinobacteria 相對豐度有增加的趨勢，Defluviicoccus屬相對豐度具有降低的趨勢。

2.6 養殖環境（水、底泥）對克氏原螯蝦腸道菌群結構的影響（見圖6、表6）

圖6 池塘與稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道、水及底泥微生物相關性分析

表6 克氏原螯蝦腸道優勢菌屬與底泥和水體微生物相關性分析

由圖6 可知，蝦腸道微生物菌群與底泥和水體微生物菌群均存在顯著正相關關系（P＜0.05），且蝦腸道微生物與底泥微生物的相關性更高。

由表6 可知，蝦腸道、水體和底泥優勢菌屬間的相關性分析（P＜0.05 且相關系數絕對值＞0.8）顯示，共有29 個腸道優勢菌屬與底泥和水體微生物顯著相關，其中23 個與底泥微生物顯著相關，22 個與水體微生物顯著相關，16 個與底泥和水體微生物均顯著相關。Verrucomicrobiaceae兩個未知屬、Cyanobacteria未知屬及Luteolibacter主要受底泥微生物影響， 而Chthoniobacterales未知屬及Planktothrix主要受水體微生物影響。

3 討論

3.1 不同養殖模式對克氏原螯蝦生長性能、腸道菌群結構的影響

克氏原螯蝦的生長受到諸多因素的影響。本試驗中，克氏原螯蝦的體生長性能在不同的養殖模式下無顯著差異?？赡苁且驗楸狙芯恐锌耸显r的放養密度和水草覆蓋度適中。

腸道微生物可以調節腸道環境，促進腸道菌群平衡，維護宿主健康[18]。在宿主與腸道菌群長期共同進化的過程中，某種或某些特殊的微生物會定植在腸道中，形成該宿主腸道內的核心菌群[19]。核心菌群很少受到宿主馴養狀態和飼養環境的影響。Tzeng等[20]發現，不同棲息環境中日本沼蝦的腸道核心菌群主要為變形菌門，其次為厚壁菌門和放線菌門。本試驗研究發現，兩種飼養模式下小龍蝦的核心菌群主要為變形菌門，其次是厚壁菌門和疣微菌門，與上述研究結果相類似。有研究表明，水生動物腸道菌群的結構組成受遺傳、飼養環境和飼料組成等因素影響[21]。嚴雪瑜等[22]報道，稻田養殖模式下的鯉魚腸道菌群多樣性高于池塘養殖模式。在本試驗中，稻田養殖模式下蝦腸道菌群多樣性低于池塘養殖模式，這可能是稻田水體環境中微生物多樣性偏低導致。本研究后續比較池塘和稻田水體微生物多樣性發現，稻田水體中微生物多樣性顯著低于池塘。從門的分類水平上可見，在稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道放線菌門的相對豐度顯著增加。放線菌是腸道的優勢菌群，具有產生短鏈脂肪酸的能力，并且其代謝產物具有抑菌活性[23]。本研究發現，在屬水平上，稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道囊裸藻屬（Trachelomonas）相對豐度降低，而浮絲藻屬 （Planktothrix） 相對豐度增加。 囊裸藻屬（Trachelomonas）分布較廣，為湖泊、沼澤等靜水水體中常見的浮游微生物，其大量繁殖時使水呈棕褐色。稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道放線菌和囊裸藻屬（Trachelomonas）相對豐度改變的原因可能與稻田水質的改善有著緊密聯系。根據上述結果可以推測，稻田養殖模式下克氏原螯蝦腸道微生物結構可能更健康。

3.2 稻田與池塘水體微生物組成對克氏原螯蝦腸道微生物的影響

水生動物的消化道短，腸道微生物極易受水環境的影響[24]。研究表明，微生物可以通過水環境引起水生動物腸道菌群結構發生改變[25]。本研究中，水體微生物的主要菌門為變形菌門、藍藻門、放線菌門和疣微菌門，這與克氏原螯蝦腸道的優勢菌群基本一致。稻田水體微生物多樣性顯著低于池塘水體，造成這一結果的原因可能是水稻大量吸收水體中的營養素，水體清瘦，導致微生物數量較少[26]。本試驗中，在門水平，稻田水體微生物的變形菌門，放線菌門和疣微菌門相對豐度顯著低于池塘水體，而藍藻門相對豐度顯著高于池塘水體。所有的變形菌門細菌為革蘭氏陰性菌，其外膜主要由脂多糖組成，因此該門包括很多致病菌[27]；放線菌門會促使土壤中的動物和植物腐爛，同時放線菌具有一種土霉味。因此，推測稻田水體中變形菌門和放線菌門相對豐度較低表明稻田中水質更好。本試驗中，在屬水平，稻田水體微生物魚孢菌科（Uncultured Sporichthyaceae）、藍藻細菌（Cyanobacteria）和聚球藻屬（Synechococcus）相對豐度顯著高于池塘水體。這可能是由于稻田充足的陽光照射刺激了藍藻菌屬生長，也可能是因為稻田水質較好菌群多樣性低，藍藻菌屬對營養物質的競爭壓力減小[28]。

3.3 稻田與池塘底泥微生物組成分析

池塘和稻田底泥中主要的微生物菌門為變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門等[29]。本研究結果顯示，池塘與稻田底泥微生物多樣性沒有顯著差異，在門和屬水平上，微生物菌群結構的差異也不大。研究表明，植物種植可以引起土壤中微生物群落組成和豐度的變化，植物能夠通過對土壤養分和水分的吸收以及根系分泌物的釋放來調控周圍的土壤，從而對微生物施加選擇性壓力[30-31]。本研究發現，池塘和稻田底泥微生物菌群結構差異不大，可能是養殖克氏原螯蝦池塘內種植的水草也具有相似的土壤調控作用。

3.4 底泥與水體對克氏原螯蝦腸道菌群結構的影響

本研究中的相關性分析結果表明，克氏原螯蝦腸道菌群結構與底泥和水體微生物均具有顯著正相關關系，表明蝦腸道微生物菌群結構受底泥和水體微生物的正向調控。而蝦腸道微生物菌群與底泥微生物相關性更強，表明底泥微生物菌群對蝦腸道微生物的影響更大，與在南美對蝦和小龍蝦上的研究結果相一致[32-33]。因此，可推測這一結果可能與克氏原螯蝦的生活習性密切相關，小龍蝦具有穴居性，洞穴深度一般在30 cm左右，此外小龍蝦會采食底泥中的腐殖質有機碎屑[34]。

4 結論

池塘和稻田兩種養殖模式下克氏原螯蝦腸道菌群結構差異顯著，受養殖環境水和底泥的正向調控，其中受底泥微生物的影響更大。