乳酸菌發酵中藥對大鼠痛風癥狀的影響研究

陳 妍 李市場杜瑩瑞 胡鋒陽 丁 慧 龔明貴

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471000）

痛風是最常見的炎癥性關節炎之一[1]，高尿酸血癥是痛風發生的主要因素[2]。痛風發作可引起常見的腎臟疾病等并發癥[3]。家禽痛風是一種蛋白質代謝障礙引起的高尿酸血癥，其病理特征為血液尿酸水平增高，尿酸鹽在關節囊、關節軟骨、內臟、腎小管及輸尿管中沉積。趙運吉[4]對高蛋白飼料引起的雛鵝痛風進行研究，發現通過摻拌粗飼料、減少日糧供應量、多喂青飼料等方法降低日糧蛋白質含量可以減少尿酸的產生。

白楊素是一種天然存在于蜂蜜、蜂膠和蘑菇中的類黃酮化合物。Chang等[5]研究發現，白楊素具有抗高尿酸和抗炎作用，可以輔助治療痛風。本文研究的中藥發酵液的原料含有車前草、土茯苓、桑葉等藥材。單純的中藥發酵風味差，為改善中藥本身苦澀的口感，可添加少量的果蔬（如檸檬、柚子、獼猴桃、馬齒莧等）作為輔料，自然發酵。本試驗研究中藥發酵液對痛風性關節炎大鼠血清指標以及腎臟、踝關節相關指標的改善效果，探究其作用機制，為中藥發酵液在動物生產中應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 中藥發酵液

中藥發酵液由洛陽糠豪川禾科技有限公司提供（發酵用優勢菌種為戊糖乳桿菌和美洲虎乳桿菌，將馬齒莧、苦蕎等干燥研磨過80目篩混合作為底物，液體厭氧發酵180 d）。

1.1.2 試驗動物

雄性大鼠60只，雄性，SPF級，體重（200±20）g，購自河南科技大學基礎醫學院（試驗動物許可證明編號：SYXK（豫）2020-0008）。

1.1.3 試驗試劑

1,1-二硝基-2-三硝基苯肼、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，購自默克化工技術（上海）有限公司；維生素C、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鄰苯三酚，購自天津市德恩化學試劑有限公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，購自上海易匯生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設備

高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；BCD-318AT 型臥式冷凍箱（海爾電器有限公司）、生化培養箱（太倉精宏儀器設備有限公司）、ME203E/02 型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、iMagic-V7型全自動生化分析儀（深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司）。

1.2 發酵液成分分析

樣品從-80 ℃冰箱中取出解凍后，渦旋10 s混勻。取混勻后的樣本200 μL，置2 mL離心管，加入200 μL提取劑提取。渦旋5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，于進樣瓶中保存，委托嘉興邁維代謝生物科技有限公司進行HPLC-MS/MS檢測，并由該公司協助進行數據分析。

HPLC-MS 條件：色譜柱，Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相，A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B 相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度，0 min B 相比例為5%，9.00 min 內B 相比例線性增加至95%，并維持在95% 1.00 min，10.00～11.10 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14.00 min；柱溫40 ℃；流速0.35 mL/min；進樣量4 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V （正模式）/-4 500 V （負模式），簾氣（CUR）25 psi，碰撞誘導電離（CAD）參數設置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對根據優化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進行掃描檢測。

1.3 急性毒性試驗

從河南科技大學醫學院購買大鼠30 只（雄性）隨機分成3 組，分別灌胃低濃度（20%）發酵液、中濃度（40%） 發酵液、 高濃度（60%） 發酵液16 mL/kg，在每天灌胃1 次的情況下，持續灌胃15 d，觀察試驗大鼠均無不良反應，表明發酵液無毒性可進行后續試驗。

1.4 試驗設計

選擇60只雄性大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、發酵液低濃度組、發酵液中濃度組、發酵液高濃度組。所有大鼠自由進食和飲水，適應性喂養3 d后開始試驗?？瞻讓φ战M給予正常大鼠飼料，其余組大鼠均給予2%氧嗪酸鉀聯合12%酵母膏飼料，連續造模4周。陽性對照組（別嘌醇片組：濃度為0.52 g/L）、發酵液低濃度（20%）組、發酵液中濃度（40%）組、發酵液高濃度組（60%）組大鼠灌胃16 mL/kg 對應濃度的發酵液，空白對照組和模型對照組大鼠灌胃相應體積的生理鹽水。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 樣品采集

試驗結束后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min 離心15 min 得到血清。取腎臟、踝關節，用4 ℃的生理鹽水沖洗，洗盡殘血，以4%甲醛固定。

1.5.2 腎臟指數、踝關節周徑

使用卷尺緊貼大鼠踝部最細處，水平環繞一周，記錄測量結果，即踝關節周徑。甲醛固定的樣本進行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，供常規光鏡下切片的病理形態學變化觀察，計算腎臟指數。

1.5.3 血清生化指標

取適量存放于EP 管中處理后的大鼠血清，血清中尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量按試劑盒說明書進行測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數據統計與分析

試驗數據采用Word 和Graphpadprism8 作圖，SPSS統計軟件進行單因素方差分析，采用t檢驗比較組間差異顯著性。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 中藥發酵液成分分析

利用軟件Analyst1.6.3處理質譜數據，得到混樣樣品質譜分析總離子流，見圖1。

圖1 混樣樣品質譜分析總離子流

中藥發酵液成分分析見表1。

表1 中藥發酵液成分分析

由表1可知，中藥材發酵液中主要含有9種物質，其中含有黃酮類化合物55種，相對含量占15.39%。

2.2 不同濃度發酵液對大鼠踝關節周徑的影響（見表2）

由表2 可知，治療后高濃度發酵液組大鼠踝關節周徑與空白對照組最為接近，極顯著低于模型對照組（P＜0.01），說明高濃度發酵液能夠有效改善大鼠踝關節痛風癥狀。

2.3 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠腎臟指數的影響（見圖2）

圖2 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠腎臟指數的影響

由于尿酸鹽通過腎臟，會加大腎臟的負荷。尿酸鹽在腎臟沉積，腎臟萎縮，導致腎臟受損質量減輕，腎功能衰退。由圖2 可知，發酵液能夠明顯抑制這種趨勢，高濃度發酵液組大鼠的腎臟系數與空白對照組最為接近，作用效果最明顯。高濃度發酵液組腎臟指數高于模型對照組，極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。

2.4 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清UA 含量的影響（見圖3）

圖3 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清UA含量的影響

UA產生過多與腎損害有關，是引發高尿酸血癥的關鍵因素，而高尿酸血癥是痛風發生的重要生理生化基礎。由于UA過高會造成尿酸鹽沉積，本研究通過測定大鼠血清UA含量判斷發酵液改善痛風性關節炎的效果。

由圖3 可知，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清UA含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組相比，高濃度發酵液組大鼠血清UA含量極顯著降低（P＜0.01）。結果表明，高濃度發酵液能夠有效降低大鼠體內UA含量。

2.5 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清BUN含量的影響（見圖4）

圖4 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清BUN含量的影響

BUN能夠反映腎組織健康程度，腎損傷會伴隨BUN增加。由圖4 可知，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清BUN含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組相比，高濃度發酵液組大鼠血清BUN 含量極顯著降低（P＜0.01）。高濃度發酵液組大鼠血清BUN 含量明顯低于其他組，表明高濃度發酵液可降低血清BUN含量，保護腎損傷。

2.6 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清Cr含量的影響（見圖5）

圖5 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清Cr含量的影響

Cr 是肌肉在人體內代謝的產物，主要由腎小球濾過排出體外。腎臟損害伴隨著BUN 和血Cr 的增加[6-9]。由圖5 可知，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清Cr含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組相比，高濃度發酵液組大鼠血清Cr含量顯著降低（P＜0.05），表明高濃度發酵液能夠降低大鼠血清Cr含量，減少腎損傷。

2.7 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清IL-1β 含量的影響（見圖6）

圖6 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清IL-1β含量的影響

痛風性關節炎大鼠足腫脹程度與炎癥因子[10]有關。由圖6 可知，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清IL-1β 含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組相比，高濃度發酵液組大鼠血清IL-1β含量顯著降低（P＜0.05）。結果表明，高濃度發酵液能夠抑制炎性因子表達，減輕水腫及炎性細胞浸潤，緩解痛風性關節炎的炎癥癥狀。

2.8 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清TNF-α含量的影響（見圖7）

圖7 不同濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠血清TNF-α含量的影響

尿酸鈉結晶刺激局部組織產生大量炎性細胞因子，如TNF-α，其含量升高說明體內存在炎癥反應。由圖7可知，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清TNF-α含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組相比，高濃度發酵液組血清TNF-α含量極顯著降低（P＜0.01）。結果表明，高濃度發酵液能夠有效終止炎性細胞因子的活化，改善痛風性關節炎大鼠炎癥情況。

2.9 不同處理組大鼠腎臟損傷病理切片（見圖8）

由圖8可知，空白對照組腎色暗紅，表面光滑，外觀無腫脹，腎小管結構清晰，腎組織形態正常。模型對照組腎色暗黃，腎臟組織被膜不完整，腎小球萎縮，腎小管排列紊亂，大部分細胞點狀壞死，腎臟受損嚴重。陽性對照組腎臟病變明顯減輕，腎小管仍見擴張，管腔增大。低濃度發酵液組腎小管排列紊亂，局部細胞點狀壞死。中濃度發酵液組腎臟病變程度減輕，腎臟組織被膜較完整，個別細胞壞死。高濃度發酵液組腎組織炎性細胞浸潤明顯減輕，腎小管擴張和間質纖維化有所改善，與空白對照組腎臟狀態最為接近[11-13]。

結果表明，中藥材發酵液可在一定程度上改善腎損傷的病理學狀況，緩解損傷腎組織的炎癥，減輕炎性細胞浸潤，其中以高濃度發酵液對痛風性關節炎大鼠的改善效果最顯著。

2.10 不同處理組大鼠踝關節病理切片（見圖9）

圖9 不同處理組大鼠踝關節病理切片（100×）

由圖9 可知，空白對照組大鼠踝關節滑膜組織形態、組織結構正常，無炎性細胞浸潤，無組織水腫現象[14]。模型對照組大鼠踝關節滑膜腫脹表層受損，細胞可見明顯增生，結構排列紊亂，并伴有大量炎性細胞浸潤。陽性對照組輕微滑膜細胞增生、變性，炎細胞減少。低濃度發酵液組和中濃度發酵液組大鼠踝關節滑膜組織輕度腫脹，細胞輕度增生，結構排列紊亂。高濃度發酵液組大鼠踝關節滑膜組織輕度腫脹，細胞排列稍顯紊亂，與空白對照組狀態接近。

3 討論

3.1 中藥發酵液對大鼠腎功能的影響

中草藥經乳酸菌發酵后活性物質含量增加，大分子物質分解轉化為小分子物質。血清UA、BUN 和Cr 含量是反映腎臟功能的特異性指標。UA 是由腎臟排出體外，BUN 和Cr 是蛋白質的代謝產物，經腎臟排出。本研究中，模型對照組大鼠血清UA、BUN 和Cr 含量均明顯高于空白對照組，說明腎功能出現了問題。高濃度發酵液組大鼠血清UA、BUN 和Cr 含量均低于模型對照組，且與空白對照組接近，說明該中藥發酵液對腎功能損害大鼠的腎臟具有一定的保護作用。

3.2 中藥發酵液對大鼠血清IL-1β含量的影響

白細胞介素是一類具有多重功效的細胞因子，可由多種細胞產生，在炎癥的發生發展中起到重要作用。本研究中，模型對照組大鼠血清IL-1β 含量高于空白對照組，高濃度發酵液組顯著低于模型對照組，說明中藥發酵液能夠抑制IL-1β 炎性因子的表達，降低炎癥指標，減輕水腫及炎性細胞浸潤，緩解痛風性關節炎大鼠的炎癥癥狀。

3.3 中藥發酵液對大鼠血清TNF-α含量的影響

TNF-α主要由單核/巨噬細胞產生，是痛風性關節炎炎癥反應急劇發生發展的重要介質，對炎癥介質的抑制是有效減輕痛風炎癥的手段。本研究中，模型對照組大鼠血清TNF-α含量明顯高于空白對照組；與模型對照組相比，中藥發酵液低濃度組對TNF-α含量改善效果不明顯，高濃度組明顯降低，表明中藥發酵液對痛風性關節炎大鼠模型具有一定的抗炎和防治作用。

3.4 中藥發酵液改善痛風性關節炎作用機制探討

中藥發酵液中營養物質和其他生物活性物質含量豐富，包括所用原料自身所有成分與微生物發酵轉化后產生的新成分。微生物發酵可提高許多生物活性物質含量。類黃酮是植物次生代謝產物，來自許多水果、蔬菜、和其他植物性食物[15]。發酵液中的功效性物質包括黃酮、酚類、礦物質、功能性低聚糖、酶及其他次生代謝產物等。作為重要的中藥成分，黃酮生物活性廣泛[16-17]。本研究結果顯示，與模型組相比，高濃度發酵液組大鼠血清中UA 和BUN 含量極顯著降低，說明高濃度發酵液能夠通過抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性保護由UA 過高造成的腎損傷，對改善痛風癥狀具有良好的作用。

中醫治療痛風具有多成分、多靶點、綜合調節的特點，具有較大的臨床應用前景[18]。近年來，相關學者針對中醫藥治療痛風開展了大量動物試驗研究，并取得了一定成效。翟福展[19]通過不同可飼用天然植物組方對痛風雞蛋的臨床表現、血清變化進行綜合評價，發現由積雪草、車前子、益母草、五加皮組成的方劑效果最為顯著。研究表明，以赤蒼藤、甘草、姜黃、薏仁作為防治家禽痛風病的組方，使用12 種益生菌對中藥進行發酵，肉雞痛風治愈率達82.00%[20]。本文以2%氧嗪酸鉀聯合12%酵母膏特殊飼料進行造模得到痛風動物模型，試驗結果顯示，中草藥發酵液可改善痛風動物的腎損傷。中藥發酵營養成分含量豐富，能夠降低血清UA含量，各種原料相互促進、協同增效，使其具備預防和調理痛風的功效。本試驗條件下，車前草、山楂、馬齒莧等配伍使用對2%氧嗪酸鉀聯合12%酵母膏特殊飼料飼養的高尿酸血癥大鼠具有積極的影響。因此，乳酸菌發酵中藥輔以果蔬治療痛風具有廣闊的開發前景，值得進一步深入開發[21-23]。

4 結論

本研究結果表明，中藥發酵液對由高UA引起的腎損傷具有一定保護作用，對痛風性關節炎大鼠具有一定的消炎作用，以高濃度效果最為明顯。