菌肥對設施芹菜產量及土壤細菌群落結構的影響

章祖榮，章斯斯，徐蔣來

（1.浙江國旵生態科技有限公司，浙江臺州 318020；2.臺州市農業科學研究院，浙江臺州 317000）

2021 年，浙江省臺州市蔬菜種植面積在6.60 萬hm2左右。調查發現，種植多年蔬菜土壤出現板結、酸化、養分失衡、團粒結構破壞等問題時有發生，土壤微生物群落結構遭到嚴重破壞。而土壤細菌是土壤微生物中最活躍的因子，占土壤微生物總數的70%～90%。因此，研究土壤細菌群落結構具有重要的意義。

化肥對增加土壤肥力和提高作物產量起著重要的作用，但同時也帶來一系列問題，如農業生態系統破壞、環境污染嚴重、作物品質和土壤質量下降等[1-2]。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，驅使土壤有機物分解，參與物質循環過程，是最重要的土壤肥力活性因子，其物種多樣性是生態系統穩定的關鍵。一般而言，穩定性較好的土壤，微生物抵抗環境惡化的能力較強。微生物菌肥作為綠色環保的新型肥料，含有大量有機質和有益微生物，如枯草芽孢桿菌等。其中，有益微生物在其生命活動過程中，產生大量次生代謝產物有機酸，不斷釋放土壤中的遲效態氮磷鉀[3]。研究發現，施用微生物肥料增加了土壤速效養分和有機質等含量，提高土壤脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶等活性[4]。因此，微生物菌肥通過改善土壤質地、增加土壤養分有效性和調節土壤微生物區系結構組成來提高土壤生物活性，使土壤向健康方向發展[5]。

高通量測序以測序數據量大、可信度高優勢成為研究微生物群落多樣性的主要方法之一。目前主要研究集中在林木、糧食作物為研究對象或不同菌肥類型處理對其的響應，而不同菌肥量代替化肥對設施芹菜土壤細菌群落結構的影響鮮有報道[6-11]。因此，本研究以設施芹菜土壤為研究對象，設置三個不同菌肥量替代化肥的梯度，通過高通量測序技術，分析其對土壤細菌群落結構多樣性的影響，探明改良設施芹菜土壤的最佳微生物菌肥量，為揭示微生物菌肥肥效提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地選擇在浙江省臺州市黃巖區南城街道藥山村蔬菜大棚（28°60′N，121°28′E）。該地屬亞熱帶季風濕潤氣候，溫暖濕潤，四季分明，年平均氣溫16.9 ℃，10 ℃以上的平均年積溫5 316 ℃，無霜期253 d，年均降水量1 391 mm，年均蒸發量1 231.4 mm。試驗地土壤性質為粘土，基礎土樣pH 值為5.30，有機質44.4 g·kg-1，有效磷669.5 mg·kg-1，速效鉀125 mg·kg-1，水解性氮185.6 mg·kg-1。

1.2 試驗材料

微生物菌肥采用北京中耕綠洲生態科技有限公司的中耕沃土生物有機肥，其中含有效活菌數5.0億·g-1，有機質40%，富含枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌?；蕿閺秃戏?，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=15∶15∶15。

1.3 試驗設計

試驗共設計9 個小區，每小區面積333.3 m2。試驗地前茬作物為小白菜，在2021 年10 月25 日開始試驗布置，共設置3 個處理：1 500 kg·hm-2化肥（CK）、微生物菌肥1 500 kg·hm-2+750 kg·hm-2化肥（T1）、微生物菌肥3 000 kg·hm-2+750 kg·hm-2化肥（T2），每個處理均配施雞糞有機肥4 500 kg·hm-2，每處理3 次重復。于2021年10月30日種植芹菜，日常管理同常規。2022 年1 月5 日采收、測產，并于當日采用五點取樣法采集土樣，剔除枯葉等雜質后裝入無菌聚乙烯封口袋中，混合均勻，-80 ℃低溫保存，用于高通量測序。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤細菌群落結構測定

土壤基因組DNA 的提?。菏紫葘颖静捎肅TAB方法提取總的DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。

目標片段PCR擴增：以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物，Buffer 和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。

PCR 產物的混樣和純化：PCR 產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR 產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產物，剪切回收目標條帶。產物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific 公司的膠回收試劑盒回收產物。

文庫構建和上機測序：使用Thermofisher 公司的建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后，進行NovaSeq 上機測序（北京果殼生物科技有限公司）。

1.4.2 芹菜品質測定

每個小區采集芹菜莖1 kg 用于測定粗纖維和維生素C 含量。其中粗纖維含量的測定方法參照《GB/T 5009.10-2003》；維生素C 含量的測定方法參照《GB 5009.86-2016》。

1.4.3 芹菜產量測定

每個小區選取3 m2面積，采用人工拔取，去除根部，用精度為0.01 g 的電子秤測產，最后換算成每公頃產量。

1.5 數據分析

測序后對原始數據進行拼接、過濾、去除嵌合體處理，得到優化序列，進行Alpha 多樣性分析、物種組成分析及物種差異分析。試驗數據均采用Microsoft Excel 2010 進行統計分析，SPSS 19.0 進行方差和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤測序結果和α 多樣性指數的影響

稀疏曲線用于驗證測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。圖1 反映了持續抽樣下新物種出現的速率：在0～60 000 條范圍內，隨著測序條數的加大，曲線趨于平緩，表示此環境中的物種并不會隨測序數量的增加而顯著增多，說明此次測序可以反映不同肥料處理對土壤細菌群落結構多樣性的真實情況。

圖1 不同肥料處理下土壤細菌群落的稀疏曲線

由表1 可知，對不同肥料處理土壤進行Nova Seq高通量測序，所測數據經過去除嵌合體序列處理后，每個樣品有效序列總數在57 468～62 744 個。在97%相似度水平下，每個樣品細菌OTU總數在894～1 371，覆蓋度均在99.9%以上，說明即使開展更深的測序也不會產生更多的OTUs數，即測序文庫已達到飽和狀態。

表1 不同施肥處理對土壤測序結果和α多樣性指數的影響

Chao1 指數表示物種豐富度，Shannon 和Simpson指數表示物種多樣性。由表1可知，在物種豐度方面，T1和T2處理使Chao1 指數有不同程度的降低，平均值分別較對照降低了33%和14.6%。相對于Shannon 指數，T1和T2處理同樣使Shannon 指數有不同程度的降低，平均值分別較對照降低了13.5%和4.8%，表明T1和T2處理導致土壤中細菌多樣性降低，且T1處理效果更明顯。相對于Simpson 指數，T1處理最小為0.99，CK和T2處理均為1.00?？傮w而言，T1和T2處理對土壤細菌豐富度和多樣性具有一定程度的抑制作用，且T1處理更明顯。

Venn圖可用于統計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種數目，比較直觀地表現環境樣本的物種組成相似性及重疊情況。從圖2 可知，經不同施肥處理的土壤共有細菌OTU 數為286 個，分別占CK、T1、T2處理組總OTU 數的17.00%、23.93%、19.18%。CK、T1、T2處理特有的細菌OTU 數分別為936、351、715 個，分別占各處理總OTU 數的55.71%、29.37%、47.95%。說明T1處理對細菌的影響大于T2處理，T2處理土壤中的細菌組成與CK處理更接近。

圖2 不同處理下土壤細菌OTU分布Venn圖

2.2 不同施肥處理對土壤細菌群落結構的影響

利用PCA 分析土壤細菌群落結構相似性與差異性，通過主成分分析可以實現多個樣品的分類，進一步展示不同樣品間物種多樣性差異，坐標圖上距離越近的樣品，樣品的組成越相似。由圖3 看出，PC1 是造成樣品差異性的最大主坐標成分，其次是PC2，分別解釋了28.31% 和25.04% 的貢獻率，兩個主坐標軸總貢獻率達53.35%。T2處于第一象限，CK 處于第二象限，T1處于第四象限，說明不同菌肥處理改變了細菌群落結構。在PC1維度上，將CK 處理和其余2個處理分開，說明CK 處理與T1、T2處理間細菌群落結構存在差異性。

圖3 不同處理下土壤細菌群落結構PCA圖

土壤樣品中共檢測出細菌23 門70 綱141 目206 科308屬139種。由圖4可知，在門水平下，排在前10的優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞(Gemmatimonadetes)、髕骨細菌門(Patescibacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)、棒狀桿菌門(Rokubacteria)。變形菌門(Proteobacteria)作為三個處理的優勢菌門，相對豐度均占據50%左右。相比對照CK，T1、T2處理下滋生土壤厚壁菌門(Firmicutes)，這與菌肥中所含菌種為芽孢桿菌屬有關，系厚壁菌門類，且T1處理占比大于T2處理。相比CK，T1和T2處理降低了酸桿菌(Acidobacteria)含量，且T1效果更明顯。相比對照CK，T1和T2均提高了土壤中放線菌門(Actinobacteria)的含量。

圖4 不同菌肥量處理下細菌門水平相對豐度

在屬水平上，排在前十的優勢菌屬分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、馬賽菌屬(Massilia)、Unclassified_f_Spor olactobacillaceae、Unclassified_o_Saccharimonadales、Unclassified_f_SC-I-84、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Unclassified_f_uncultured、羅河桿菌 屬(Rhodanobacter)、Unclassified_c_ Subgroup_6、芽孢桿菌屬(Bacillus)。由圖5 可知，T1相比對照CK，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)含量明顯降低。本研究發現，T1處理馬賽菌屬(Massilia)含量明顯高于CK 和T2。研究發現，芽孢桿菌屬T1處理占比高于T2和CK 處理，類芽孢桿菌屬與其類似。

圖5 不同菌肥量處理下細菌屬水平相對豐度

2.3 不同菌肥量處理對設施芹菜產量的影響

由表2可知，通過不同肥料處理下設施芹菜產量表現T1最高，為88.9 t·hm-2，與CK 相比提高了23.3 t·hm-2，且達到顯著性差異。其次為T2處理，產量96.7 t·hm-2，比CK 處理提高了7.8 t·hm-2。說明不同菌肥量代替部分化肥處理對設施芹菜產量均有不同程度的提升。芹菜莖的粗纖維和維生素C含量，T1處理分別比CK提高了0.1%和1.3 mg·(100 g)-1。

表2 不同菌肥量處理對設施芹菜產量及部分品質的影響

3 討論與結論

大量研究表明，不同肥料類型或用量與土壤微生物數量、組成及結構多樣性差異之間緊密相關[12-15]。本研究發現，在門水平上，T1、T2處理下滋生土壤厚壁菌門。厚壁菌門表現為球狀或者桿狀，很多厚壁菌可以產生芽孢，可以抵抗脫水和極端環境。有一類厚壁菌，太陽桿菌科可以通過光合作用產生能量。研究發現，T1和T2處理降低了酸桿菌(Acidobacteria)含量。有研究表明，酸桿菌為貧營養細菌，多存在于營養貧瘠的土壤環境中，其豐富度與土壤質量呈負相關，且酸桿菌具有嗜酸性，其豐度增加土壤呈酸化[16-18]。放線菌的代謝活動能促進動植物等有機物質的分解，細化成作物可以直接吸收利用的有效磷、有效氮、有效鉀等成分。研究發現，T1和T2均提高了土壤中放線菌門(Actinobacteria) 的含量。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)作為一種解磷菌，能夠提高土壤中有效磷含量，增加土壤肥力，促進植物生長，緩解作物連作障礙。有研究發現，低濃度的鞘氨醇單胞菌液處理更能有效促進連作西瓜幼苗的生長，此現象可能由于菌株投加密度過大，導致生存空間不足，致使其菌內競爭加大，影響了根際微生物的群體效應[15]。本研究結果發現T1相比對照CK，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)含量明顯降低。馬賽菌屬(Massilia)具有參與碳氮循環、分泌生長素和酶、溶磷、降解多環芳烴菲、抗多種重金屬等功能，在防治土傳病害、修復土壤方面具有重要作用。本研究發現，T1處理馬賽菌屬(Massilia)濃度明顯高于CK和T2。芽孢桿菌具有激活土壤、提高有機質分解能力、提高抗逆性、凈化環境、抑制有害菌等功能。本研究發現，芽孢桿菌屬（Bacillus）和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)濃度表現為T1處理最高，其次為T2處理，可能是因為菌肥中所含菌種為芽孢桿菌屬，而施用量過高導致土壤孔隙度降低，土壤透氣性差，反而不利于其繁殖。

微生物菌肥中有多種有益微生物，加速動植物殘體的腐化和纖維素的降解，增加土壤有機質含量，分泌的膠性物質促進土壤團粒結構的形成，使土壤疏松。同時，微生物代謝產生的酸類物質促進土壤養分的分解，從而提高土壤肥力，提升作物品質，增加產量。本研究發現，T1和T2處理均不同程度地提升了芹菜的產量及粗纖維、維生素C含量。

通過研究不同微生物菌肥量替代部分化肥對設施芹菜土壤細菌群落結構多樣性和產量的影響，結果表明，從Chao1 指數和Shannon 指數看出，T1和T2處理對土壤細菌豐度和多樣性具有一定程度的抑制作用，且T1處理更明顯；從PCA 分析可知，T1、T2處理與CK 處理間細菌群落結構存在差異性；從門和屬水平分析土壤細菌群落結構，發現T1處理提高土壤芽孢桿菌等有益菌的濃度，且增加程度高于T2處理，這對修復土壤生態環境具有良好的效果；T1和T2處理提高了芹菜的產量和粗纖維、維生素C 含量，且T1效果更明顯。綜合考慮，T1處理對設施芹菜土壤細菌群落結構和產量的效果最佳。