基于UPLC-MS/MS的林下三七不同部位生物堿類成分分析

張 澳，嚴星茹，熊冰杰，黃佑國，何 舒，周發金，王 澍，施 蕊

（西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室/昆明生態林業產業國際科技研發中心/西南林業大學園林與園藝學院，云南昆明 650224）

五加科人參屬三七[Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen]作為云藥的代表聞名杏林，《本草綱目》譽之“金不換”“補血第一”，即具備散瘀止血、消腫止痛的功效[1]。近年來云南三七產量全國占比高達98%以上，正逐漸形成種植加工銷售一體化的龐大產業體系[2]。國家中醫藥發展戰略提出需要全面提升中藥產業發展水平即實現產業轉型升級[3]，而三七產業轉型升級過程發現了一個嚴重的門檻，三七產品開發深度和廣度不足導致三七產值低、產業鏈短[4-6]。因此，為增加三七產值和延長三七產業鏈，提高三七資源的綜合利用率是十分必要的。

現階段，三七的研究領域主要集中于三七的傳統入藥部位根部及其皂苷類成分[7-8]，有關三七不同部位和非皂苷類成分的研究較少。三七的果實和葉片作為其生長發育過程中的伴生產物，常常順應自然凋落腐爛，實際是一種資源浪費。生物堿類成分是植物體內的一類次生代謝產物，根據化學結構可分為吡咯、吡啶、吲哚等十余種[9]，具備豐富的生物活性，王騰飛等研究發現其具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗菌等多種藥理作用，在植物的適應性、抗逆性等方面也發揮著重要作用[10]。因此，為增加三七資源綜合利用的多樣性，可以從三七不同部位的生物堿類成分入手探尋新思路。

植物代謝組學，是一門采用液相-質譜聯用、氣相-質譜聯用等多種手段全面、高通量對植物化合物進行定量、定性分析的新興學科[11]。代謝組學方法正逐漸成為應用在藥用植物的中藥基原鑒別[12]、野生與栽培品的鑒別[13]、藥用部位鑒別[14-15]、不同發育期的成分鑒定及不同產地藥材的品質差異[16]等方面的有效手段。

本實驗采用廣泛靶向代謝組學方法對三七的果實、葉片、根的生物堿類成分進行分析，

通過主成分分析(PCA)結合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的方法，篩選三七不同部位的差異化合物，探尋鑒別三七部位的生物堿類標志物，挖掘三七果實、葉片和根部的利用價值，以期為提高三七資源的綜合利用率提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗樣品林下三七采集于瀾滄竹塘（N22.74°，E99.82°，H1 457.39 m），按不同部位分為果實、葉片、根，即三組樣品，每組3 次生物學重復，樣品信息如表1所示。

表1 林下三七樣品信息

儀器：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）和串聯質譜儀（Tandem mass spectrometry，MS/MS）；凍干機（Scientz-100F）；研磨儀（MM 400,Retsch）；離心機；渦旋儀，精密天平。

試劑：甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）；標準品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）；純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備和提取

將林下三七完整植株鮮品真空冷凍干燥成干品，然后分揀成果實、葉片、根三部分，分部位放置研磨儀中研磨成粉末（30 Hz，1.5 min），分裝編號成F（果實）、L（葉片）、R（根）備用。精密稱定100 mg粉末浸泡于1.2 mL 的70%甲醇提取液中，使用借助渦旋儀每30 min渦旋1次，每次30 s，共渦旋6次，然后充分混勻后，放置于4 ℃冰箱冷凍過夜?；旌弦河秒x心機離心（12 000 r·min-1）10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾得到濾液，裝入進樣瓶進樣分析。

1.2.2 超高效液相色譜和串聯質譜法（UPLC-MS/MS）檢測

液相條件：采用Agilent SB-C18 1.8μm（2.1 mm×100 mm）的色譜柱進行色譜分離；設置柱溫40 ℃，流速0.35 mL·min-1，進樣量4 μL；流動相A 為加入0.1%甲酸的超純水，B相為加入0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

質譜條件：采用三重四極桿線性離子阱質譜儀（Q TRAP）進行質譜分析，配備ESI Turbo 離子噴霧接口；渦輪噴霧離子源操作參數設置源溫度550°C，離子噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式），離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設置為50、60 和25.0 psi，碰撞誘導電離參數高。

1.2.3 數據處理

采用UPLC-MS/MS 方法獲得質譜峰圖，利用Analyst 1.6.3 軟件處理三七樣品質譜數據，利用MultiaQuant 軟件對質譜峰進行積分校正，完成定性定量處理。對通過混合樣本檢測得到的總離子流圖（TIC 圖）進行重疊展示分析，判斷數據的重復性、可靠性和儀器的穩定性。處理后的數據歸一化后采用多元統計分析中的主成分分析方法，對龐大復雜的數據進行“簡化和降維”，建立PCA 得分圖，根據各樣本組間、組內的分離趨勢判斷其差異程度。采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）彌補PCA 方法的不足，在原始數據進行log2 轉換后進行中心化處理，利用R 軟件中的MetaboAnalystR 包OPLSR.Anal 函數進行分析，建立OPLS-DA 正、負模型，得到OPLS-DA 得分圖、OPLS-DA S-plo 圖、VIP（投影中變量重要性）圖和聚類熱圖，使組間區分最大化，篩選出差異化合物。結合PCA 分析和OPLS-DA 分析，采用VIP 值和FC值（差異倍數值）組合的方法判斷三七不同部位之間的差異情況，得到核心差異化合物和明確三七不同部位的開發利用價值[17]。

2 結果與分析

2.1 生物堿類化合物的定性定量分析

本實驗采用三七的三個部位即果實、葉片、根，共選取9個樣品進行代謝組學分析。

通過UPLC-MS/MS 方法檢測所得MRM 化合物檢測多峰圖（見圖1），峰積分校正處理后經標準品對照和數據庫自查，結果表明一共檢測到53個生物堿類化合物，經含量對比發現果實、葉片和根的生物堿總含量具有差異性，果實＞葉片＞根。后續通過多元統計分析方法對53個生物堿類化合物進行具體分析，找出果實、葉片和根的差異化合物。

圖1 MRM化合物檢測多峰圖

2.2 主成分分析

對檢測所得的化合物進行主成分分析，建立PCA得分圖，每個點表示一個樣品，同樣的圖形表示同一組樣品，點與點之間的距離遠近表示分離效果，距離越遠分離效果越好，表示樣品間差異性越大。

如圖2 所示，第一主成分的解釋率為42.51%，第二主成分的解釋率為24.51%，表明兩個主成分能夠基本反映檢測樣的主要特征信息；mix 樣本即質控樣本，位于三個部位樣本的中間且組內趨于同一點，說明數據重復性良好、可靠；F 位于PC1 的負半軸和PC2 的正半軸，L位于PC1的正半軸和PC2的負半軸，R位于PC1 的正半軸和PC2 的正半軸，F、L、R 三者間明顯分離，說明果實、葉片和根之間的生物堿類成分差異明顯。

圖2 PCA-2D得分圖

2.3 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘法判別分析方法可以與PCA 方法互補，更全面地計算成分間的相關性，去除不相關的差異信息，使組間區分最大化篩選差異化合物。對三個部位作兩兩對比即FvsR（果實和根對比）、LvsR（葉片和根對比）、FvsL（果實和葉片對比），進行OPLS-DA 分析區分不同部位的組間差異，結果再一次論證果實、葉片和根之間的生物堿類成分差異明顯，與PCA 分析所得結果一致。其中FvsL 差異性比FvsR 和LvsR 較低，加之與傳統藥用部位根作對比更有意義，所以繼而將重點分析FvsR 和LvsR 的差異化合物。

以VIP ≥1，FC（差異倍數值）≥2 和FC ≤0.5 作為篩選標準明確不同部位間差異顯著的化合物，FvsR篩選得到26 個差異化合物，下調22 個，上調4 個；LvsR 篩選得到24 個差異化合物，下調15 個，上調9個。如圖3 所示，正值（或空心圓）代表上調差異表達化合物，負值（或實心圓）代表下調差異表達化合物，上調表示該化合物在根中的相對含量較高，下調表示該化合物在根中的相對含量較低。果實和根對比中發現，上調最明顯的物質是乙酰色胺（pmb0131），下調最明顯的物質是油酰單乙醇胺（mws0983）；葉片和根對比中發現，上調最明顯的物質是乙酰色胺（pmb0131），下調最明顯的物質是N-甲基煙酰胺（pma6298）。

圖3 VIP值圖和差異倍數圖（左為FvsR，右為LvsR）

2.4 差異化合物分析

多元統計分析篩選得到FvsR 和LvsR 組間差異明顯，FvsR 的下調物占比為84.6%，LvsR 的下調物占比為62.5%，表明果實、葉片的生物堿類成分比根中更多，同時可以作為鑒別部位的一類標志物。下調表示該化合物在果實或葉片中的相對含量比根高，因此重點關注下調化合物，繼而可以發現不同部位開發利用價值的多樣性。

對比分析組間差異化合物中下調明顯的前三個物質的相對含量，結果如表3 和圖4 所示，相對于根而言，3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺在果實中相對含量更高，油酰單乙醇胺下調最明顯，因為其在根中未檢測出；3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇在葉片中相對含量更高，3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺在根中未檢測出；同時發現果實、葉片兩者和根相比，兩組的上調差異化合物中最明顯的都是乙酰色胺，因為其只在根中檢測出。

圖4 差異分析柱形圖

表3 林下三七不同部位差異化合物統計

有關報道表明，三七果實和葉片中的3-吲哚丙酸、油酰單乙醇胺、3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺物質具有進一步研究的價值，可以應用于保健品、藥品等產品開發。3-吲哚丙酸是一種強大的抗氧化劑，對治療阿爾茨海默病有一定作用[18]，也是一種腸道微生物群產生的代謝產物，是2 型糖尿?。═2D）發展的潛在生物標志物，可通過保持β 細胞功能來介導其保護作用[19]。油酰單乙醇胺可通過過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)介導的機制調節脂質代謝，可以在肥胖癥治療中發揮作用[20]。3-羥基吡啶的衍生物是維生素B6的結構類似物，具有抗氧化作用等廣泛的藥理特性[21]。N-甲基煙酰胺是煙酰胺的化合物之一，可通過調節ADMA-DDAH 軸改善內皮功能障礙并減輕動脈粥樣硬化，也影響血管血栓形成[22]。而對甲氧基吲哚乙酸和5-羥基吲哚-3-乙醇有關藥理作用的研究甚少，有待發掘空間大。甲氧基吲哚乙酸可以根據其化學式C11H11NO3，參考其同分異構體的化合物——5-甲氧基吲哚-3-乙酸，是一種褪黑素的代謝產物[23]。5-羥基吲哚-3-乙醇曾在哺乳動物中被發現，是5-羥色胺的化合物，可以作為一類急性酒精攝入的標志，可以借為參考[24]。根的特有物質乙酰色胺也具備利用價值，色胺是一種單胺生物堿，在大腦中的色胺作為神經調節劑或神經遞質發揮作用，在植物中的色胺是影響植物生長和微生物群落代謝途徑的原料，它曾被發現可能是植物生長調節劑吲哚-3-乙酸生物合成途徑中的一種中間產物[25]。

3 討論與結論

本研究在林下三七的果實、葉片和根中共檢測出53 個生物堿類化合物，從生物堿總含量多少看，果實＞葉片＞根；從成分差異性看，果實和根對比有26個差異化合物，果實中3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺的含量較高，葉片和根對比有24個差異化合物，葉片中3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇的含量較高；篩選得到果實特有物油酰單乙醇胺，葉片特有物3-羥基吡啶，根特有物乙酰色胺，可以作為鑒別這三個部位的生物堿類差異標志物。

與常用的高效液相色譜、超高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用等成分分析方法相比，本研究采用的超高效液相色譜和串聯質譜法是一種更為快速、準確、可靠、直觀的方法，為中藥材成分檢測、質量評價、部位鑒別等提供新思路[26]。三七的傳統藥用部位主要是根，本研究發現三七果實和葉片的生物堿總量高于根，與崔秀明等分析總結發現三七不同藥用部位的藥用成分含量具有差異性的結論一致[27]，這說明三七不同部位的功效也可能不相同，揭示三七的果實和葉片這類地上部分也可能有利用價值。曲正義研究三七果實成分，發現三七果實成分含有抗腫瘤活性[28]，孫璠和黃積武等分析三七葉片成分，發現三七葉片成分含有抗炎活性[29]和抗氧化活性[30]，但發揮功效的具體物質及其作用機理尚未明確。本研究發現果實中含量較高的3-吲哚丙酸和油酰單乙醇胺有抗氧化、調節脂質代謝的作用，葉片中含量較高的3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺也有抗氧化、保護心血管的作用，結合前人的研究成果說明三七果實和葉片有巨大的開發利用潛力。

本研究從林下三七不同部位的生物堿類成分分析入手，旨在發現提高三七資源綜合利用率的更多可能性，結果為三七不同部位鑒別提供了新的差異標志物，為三七果實和葉片的科學開發利用提供參考價值。針對性了解三七的生物堿類成分，能夠為開發創新產品提供科學依據，促進三七資源開發利用多樣性發展。