外源獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗生長的緩解效應

史沉魚，吳梁艷

（河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州 546300）

不利的外部條件，如干旱和高鹽度，會對植物的生長產生不利影響。土壤鹽堿化是影響植物生長發育的主要非生物因素之一。植物生長發育過程中對外界環境的變化非常敏感，在不利的環境下，植物會通過調控自身生理生化指標、體內激素水平及脅迫響應基因的變化等多種途徑來抵抗逆境[1]。鹽脅迫是土壤中鹽離子特別是Na+和Cl-的過量積累，嚴重影響植物的正常生長發育[1]。植物的耐鹽機理涉及方面較多，其中生理水平的自我調節是植物體表現出耐鹽特性的主要機制[2]。研究發現，施加外源激素可以降低Na+、Cl-在細胞中的含量。當植物遇到緊急脅迫時，最直接有效地緩解脅迫危害的一種方式就是噴施外源物質。

黃瓜（Cucumis sativusL.）系葫蘆科黃瓜屬植物，廣泛種植于溫帶和熱帶地區[3-4]。黃瓜是一種非鹽生植物，根淺，相對脆弱，對鹽脅迫等刺激很敏感[5]。非鹽生植物在脅迫下的生長發育受到顯著抑制。有研究表明，不同濃度的NaCl處理對黃瓜幼苗生長的影響表現各不相同。低度脅迫對植株的生長和各生理指標影響較??；中度脅迫下植株生物量下降表現明顯，1.2%達到植株生長的極限鹽濃度[6]。鹽脅迫能夠嚴重影響黃瓜幼苗的正常生長，如植株的株高、葉片面積、地上部分鮮重、總根長度等都會降低。研究發現NaCl脅迫對黃瓜幼苗地上部分和根系的影響稍有區別，鹽脅迫會降低CAT、POD、SOD 等抗氧化酶的活性，細胞膜的透性受到影響，導致細胞的代謝不正常；鹽脅迫程度加重，植物細胞受到的傷害也越大[7]。在鹽脅迫下，氣孔或非氣孔因素是影響作物光合作用的主要因素，其中影響氣孔的因素包括光、CO2、氣孔振動、植物激素及其他[8]；高鹽會導致作物葉片氣孔關閉，光合速率降低[9]。

獨腳金內酯(strigolactones，SLs)是一類萜類小分子化合物，廣泛存在于植物界中[10]。獨腳金內酯是一些天然獨腳金醇類化合物及人工合成類似物的總稱，現已被公認為第七大植物激素，可作生長調節劑[11]。SLs主要在根中合成，莖、芽等組織中合成量極低[12]?，F已從植物根系分泌物中分離和鑒定出約20 種天然SL，此數量還會繼續增加[13]。獨腳金內酯合成途徑中的關鍵基因有D27、D17和D10[14]。目前在獨腳金內酯生物學功能的科學研究中被廣泛應用的是GR24。如在擬南芥突變實驗中，施加GR24 能明顯改善突變體對干旱和鹽害脅迫的抵抗能力[15]。外施SLs 在一定程度上會增加CAT、POD、SOD 等抗氧化酶的活性，抑制H2O2和MDA 的產生，抗氧化酶活性越高，對鹽脅迫的適應性越強[16]。近年來，研究發現SLs 在植物干旱、鹽、營養缺乏等非生物脅迫響應中發揮關鍵作用[17]，調節獨腳金內酯代謝相關基因的表達有助于植物的生長發育和抗逆性的變化[18]。然而獨腳金內酯在植物生長發育多個方面的調控作用還不明確，特別是其對鹽脅迫下植物生理特性的影響還有待進一步研究。本試驗以黃瓜幼苗為對象，研究外源獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗的種子萌發、幼苗滲透調節物質含量和抗氧化酶活性等生理指標的影響，分析評價高鹽對植物的影響程度，為鹽脅迫下黃瓜生理生長的緩解效應提供理論支持，對蔬菜的安全生產和保障人體健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

試驗材料為津綠11號黃瓜。試劑有獨腳金內酯人工合成類似物（GR24）、NaCl、丙酮、95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉末、氮藍四唑（NBT）、EDTA-Na2、磷酸緩沖液、乙酸乙酯、牛血清蛋白、甲硫氨酸（Met）、考馬斯亮藍G-250、蒽酮、核黃素、愈創木酚。試驗儀器有分光光度計、電子天平、顯微鏡、恒溫水浴鍋、離心機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發及幼苗培養

首先選取籽粒飽滿、大小一致的黃瓜種子，在燒杯中準備適量的水，將種子浸泡進去，保證水能沒過種子，大概5～6 h 后將種子撈出，在鋪有濾紙的培養皿中將種子鋪平整，進行催芽，2 d 后將其種到土里。共設5 個處理，每個處理6 盆，每盆5 株。在27～30 ℃溫度中培養，待黃瓜幼苗長到兩葉一心時按試驗設計（見表1）進行處理。NaCl 溶液每2 d 澆1 次，共處理4 次，模擬鹽脅迫環境。再分別配制濃度為0 nM、5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 溶液對鹽脅迫組進行處理，將不同濃度的GR24 分裝到小噴瓶中均勻噴在黃瓜幼苗葉片兩側，以葉面濕潤不流滴為準；GR24噴施7 d后，分別取樣進行各項生理指標的測定，3次重復。

表1 試驗設計

1.2.2 生理指標測定方法

株高、根長、真葉數每個處理隨機測量10株。

葉綠素含量用分光光度法，超氧化物歧化酶活性用氮藍四唑（NBT）還原法，過氧化物酶活性用愈瘡木酚法，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍-G250 法，可溶性糖含量用蒽酮比色法[18]測定。氣孔結構用顯微鏡觀察，在上午8:00—12:00，每個處理觀察5 個裝片，每個裝片觀察3個視野。

1.2.3 數據處理

各處理組取3 次重復的平均值，用Excel 和SPSS軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 外源獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗外形指標的影響

由表2 可知，各處理黃瓜幼苗的真葉數之間不存在顯著差異；黃瓜幼苗的根長雖有上升趨勢，但未達到顯著水平；采用單一鹽脅迫處理組（CK2）黃瓜幼苗的株高比對照組（CK1）下降16.85%，達到顯著差異，表明鹽脅迫會使黃瓜的株高受到明顯限制。當用5 nM、10 nM、50 nM 濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的株高比鹽脅迫組（CK2）分別上升了7.39%、11.53%、14.07%，可以看出，噴施GR24 可減輕鹽脅迫對黃瓜幼苗株高的抑制作用。

表2 外源獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗株高、根長、真葉數的影響

2.2 外源獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗生理指標的影響

2.2.1 葉綠素

表3 顯示，在只有鹽脅迫（CK2）條件下，黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量較對照組（CK1）呈減少趨勢，表明鹽脅迫限制了黃瓜幼苗葉綠素的生成。當用5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 噴施鹽脅迫下的黃瓜幼苗時，黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量都比鹽脅迫下（CK2）有所提高，達顯著差異（p＜0.05）。鹽脅迫（CK2）下黃瓜幼苗的葉綠素a 含量較對照組（CK1）減少34.92%，在5 nM、10 nM、50 nM濃度GR24處理下黃瓜幼苗的葉綠素a含量比鹽脅迫組（CK2）分別增加了33.41%、41.46%、51.49%；鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的葉綠素b 含量較對照組（CK1）減少42.82%，5 nM、10 nM、50 nM 處理組黃瓜幼苗的葉綠素b 含量較鹽脅迫組（CK2）分別增加了44.72%、59.68%、64.68%；鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的總葉綠素含量比對照組（CK1）減少37.22%，5 nM、10 nM、50 nM 處理組黃瓜幼苗的總葉綠素含量比鹽脅迫組（CK2）分別增加了36.41%、46.29%、54.98%；鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的類胡蘿卜素含量比對照組（CK1）減少33.11%，5 nM、10 nM、50 nM 處理組黃瓜幼苗的類胡蘿卜素含量比鹽脅迫組（CK2）分別增加了24.33%、31.42%、41.72%。結果表明，施加GR24 可以提高鹽脅迫下黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量。

表3 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗葉綠素含量的影響 單位：mg·L-1

2.2.2 過氧化物酶

過氧化物酶（POD）與植物的很多生理活動都相關，在植物體內活性較高。如圖1 所示，采用單一鹽脅迫處理組（CK2）的黃瓜幼苗葉片的POD 活性比對照組（CK1）降低；當用5 nM、10 nM、50 nM 濃度的GR24 處理黃瓜幼苗時，葉片中過氧化物酶活性與鹽脅迫組（CK2）相比呈先下降再上升的趨勢。

圖1 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗過氧化物酶活性的影響

2.2.3 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是一種抗氧化酶，可以保護細胞免受活性氧的傷害或減少損害，在活性氧清除系統中起著重要作用。圖2所示，采用單一鹽脅迫處理組（CK2）黃瓜幼苗葉片中的SOD 活性比對照組（CK1）低；5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 處理組的黃瓜幼苗SOD活性呈上升趨勢，且處理間存在顯著差異（p＜0.05）。

圖2 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

2.2.4 可溶性蛋白

圖3 所示，用單一鹽脅迫組（CK2）的黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量較對照組（CK1）下降9.08%，達顯著性差異（p＜0.05）；GR24 處理后，可以看到黃瓜幼苗葉片的可溶性蛋白含量有升高的趨勢，達顯著性差異（p＜0.05）；5 nM、10 nM、50 nM濃度的GR24處理下，黃瓜幼苗的可溶性蛋白含量分別提高了6.34%、10.41%、7.26%。

圖3 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.2.5 可溶性糖

如圖4 所示，采用單一鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗葉片中的可溶性糖含量較對照組（CK1）下降42.22%，有顯著性差異（p＜0.05）；與鹽脅迫組（CK2）相比，GR24 處理后，黃瓜幼苗葉片中的可溶性糖含量有所提高，有顯著性差異（p＜0.05）；5 nM、10 nM、50 nM 濃度GR24 處理下，黃瓜幼苗的可溶性糖含量分別提高了39%、66%、44.83%。

圖4 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響

2.2.6 氣孔

氣孔是由一對保衛細胞包圍的孔隙，作為植物與環境之間氣體交換的通道。氣孔控制水分蒸騰和CO2吸入[19]，它在植物生長過程中起著重要的作用。鹽脅迫會導致氣孔閉合。如圖5 所示，在光學顯微鏡40 倍下觀察，黃瓜表皮分布著很多氣孔，氣孔的形態、長度及開放程度都不相同，5 個處理下黃瓜氣孔特征存在差異。

圖5 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗氣孔結構的影響

表4 顯示，采用單一鹽脅迫處理組（CK2）黃瓜幼苗的氣孔開口長度、氣孔開口寬度比對照組（CK1）下降了18.73%、31.31%，有顯著性差異（p＜0.05）；經不同濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的氣孔開口長度、開口寬度均有所提高，表明黃瓜在遭受鹽脅迫時氣孔開放受到影響，經不同濃度的GR24 處理后，氣孔開放程度有所提高；氣孔密度各處理組間雖存在差異，但未達顯著水平。

表4 獨腳金內酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗氣孔開口長度、寬度及氣孔密度的影響

3 討論與結論

3.1 討論

黃瓜幼苗對鹽脅迫很敏感，鹽脅迫下植株生長受到明顯抑制，本試驗中單一鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的株高較對照組（CK1）顯著下降，黃瓜的株高明顯受到限制；用GR24 處理鹽脅迫組的黃瓜幼苗株高有所提高，說明噴施GR24 能減輕鹽脅迫對黃瓜幼苗株高的抑制作用。

葉綠素是光合作用所必需的，它是光合生物中的一種綠色色素，有葉綠素a、葉綠素b；類胡蘿卜素在光合作用中也同樣有著重要作用。鹽脅迫（CK2）條件下，黃瓜幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量較對照組（CK1）都呈減少趨勢，鹽脅迫使黃瓜幼苗葉綠素、類胡蘿卜素的生成受到影響；5 nM、10 nM、50 nM 濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的葉綠素、類胡蘿卜素含量發生變化，較CK2 組有所提高。

處于正常生長下的植物可以平衡自身活性氧（ROS）和自由基的生成與清除，兩者很弱時，不會傷害細胞。但是當植物暴露在不利的外部條件如高鹽、干旱和洪水等環境下時，平衡就會受到影響。SOD、POD 和CAT 是植物體內重要的清除活性氧的酶，它們的活性可以用來判斷植物的耐鹽性，抗氧化酶的活性高，說明植物對鹽脅迫有較好的適應能力。一定程度的鹽脅迫下，抗氧化酶活性在短暫時間內會有增加的趨勢；脅迫程度過強時，超出植物的忍受范圍，抗氧化酶的活性則可能會降低[20]。黃瓜光合產物的形成及正常的生長發育都受到鹽脅迫的影響[21]。本試驗中，施加NaCl 對黃瓜葉片造成脅迫作用，抑制了葉片中SOD、POD 等酶活性，這與楊愛崢、李志磊等人的研究結果一致[20]。而GR24 提高了鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片中的過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，降低了鹽脅迫對黃瓜幼苗造成的傷害。

研究表明，鹽脅迫能夠誘導植株耐鹽相關基因的表達，促進蛋白質的合成和相關酶活性發生一系列的變化，調節體內相應的生理代謝[22]。鹽脅迫會抑制蛋白質合成、加速蛋白質降解等，使蛋白質含量因為受到鹽脅迫而降低。本試驗中，NaCl脅迫下，黃瓜幼苗葉片中的可溶性蛋白含量明顯下降，這與孫彤彤的研究結果一致[23]。經不同濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗葉片中的可溶性蛋白含量有所提高。

可溶性糖是一種能參與滲透調節的小分子物質，其可以通過降低細胞水勢來抵抗脅迫環境[23]。本試驗中，采用單一鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的可溶性糖含量比對照組（CK1）顯著下降，經不同濃度的GR24處理后，黃瓜幼苗的可溶性糖含量都有所提高。

葉片氣孔是植物與外界環境之間水、氣交換的重要通道。大量研究表明，鹽脅迫和CO2濃度升高都會使氣孔開度迅速縮小，甚至造成氣孔密度降低[24]。當植物受到鹽脅迫時，氣孔可能會關閉。過高的含鹽量會降低土壤中的滲透勢，反之，植物細胞的滲透勢會增加，使植物難以吸收水分和養分，嚴重情況下會導致細胞組織中的水分外滲。為了減少水分流失、防止脫水，植物關閉氣孔而降低氣孔導度。試驗用單一鹽脅迫處理組（CK2）的黃瓜幼苗氣孔開口長度、氣孔開口寬度比對照組（CK1）顯著下降，經不同濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的氣孔開口長度、開口寬度均有所提高，黃瓜在遭受鹽脅迫時氣孔開放程度受到影響，經不同濃度的GR24 處理后，氣孔開放程度有所提高，GR24能減輕鹽脅迫對黃瓜幼苗的傷害。

3.2 結論

試驗結果表明，鹽脅迫下黃瓜幼苗的株高會降低，葉片中抗氧化酶（POD、SOD）活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量等降低，葉綠素、類胡蘿卜素含量都呈下降趨勢，氣孔開放程度也受到影響。而采用不同濃度的GR24 分別對鹽脅迫下的黃瓜幼苗進行處理，黃瓜株高顯著升高，氣孔開放程度有所提高，葉綠素和類胡蘿卜素含量增加，葉片中抗氧化酶（POD、SOD）活性及可溶性蛋白、可溶性糖含量均有所提高，表明噴施GR24能有效緩解鹽脅迫對黃瓜幼苗的傷害。