玉米低聚肽和小麥低聚肽及其金屬螯合物的抗氧化和抗過敏活性

盧知浩,趙曉涵,裴晨皓,馮曉文,程青麗,谷瑞增,李國明*,劉文穎*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015) 2(北京城市學院 生物醫藥學部,北京,100083)

中國作為糧食生產消費大國,對糧食作物的開發利用是國內研究的熱點內容。玉米和小麥是我國傳統的種植作物,利用酶解等方法對糧食原料進一步加工可從中獲得相應的低聚肽[1]。相關研究表明玉米低聚肽(以下簡稱玉米肽)和小麥低聚肽(以下簡稱小麥肽)在抗腫瘤[2]、抗氧化[3-4]、降血壓[5-6]等方向展現了多樣的生物活性,在作為功能性食品基礎原料等研究中有巨大的應用價值。肽可作為主體與客體金屬離子配位,進而形成肽-金屬螯合物。該類結構利用肽的吸收機制提高了金屬離子的生物利用率,可進一步發展為新型金屬離子補充劑,有助于對微量元素的吸收[7-10]。

隨著人們對自身健康的重視程度提高,食品藥品的抗氧化能力和抗過敏活性成為該領域的研究重點。肽-金屬螯合物獨特的功能結構使其在食藥領域有廣闊的發展前景,但目前肽-金屬螯合物的研究主要集中在制備工藝、金屬離子吸收和抗菌活性等方向[11-13],對螯合物的抗氧化作用和抗過敏活性的研究則相對少見[14-15]。鈣和鐵作為人體的必需元素常被選為螯合物研究中的客體金屬離子,但該兩種元素與小麥肽、玉米肽的螯合物研究并不常見,注重于該類螯合物的抗氧化作用和抗過敏活性的研究也更為稀少。

本文選擇無水氯化鈣和氯化亞鐵分別作為鈣源和鐵源制得的新型的玉米肽-Ca螯合物和小麥肽-Fe螯合物,對玉米肽、小麥肽和兩種螯合物的抗氧化和抗過敏活性進行研究,為相關螯合物在生物活性方向和食品應用方向研究的進一步發展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米低聚肽、小麥低聚肽,浙江海氏生物科技有限公司;DPPH(色譜純),Biotopped公司;乙腈(色譜純),Fisher公司;水楊酸(分析純),天津市光復精細化工研究所;無水氯化鈣、七水合硫酸亞鐵、氯化鐵、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇(均為分析純),北京化工廠;三氯乙酸、氯化亞鐵、鐵氰化鉀(均為分析純),天津市福晨化學試劑廠;30%過氧化氫(分析純),西隴化工股份有限公司;三氟乙酸(分析純),美國Alfa Aesar公司;去離子水,實驗室自制。

1.1.2 儀器與設備

F30200150凱氏定氮儀,意大利Velp Scientifica公司;KQ-250E超聲波振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司;Dynex Spectra Mr酶標儀、EL20pH計,瑞士Mettler Toledo公司;1204007恒溫水浴鍋,蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司;DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱,北京陸?？萍加邢薰?LC-20AD高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料低聚肽理化性質分析

參考QB/T 5298—2018和QB/T 4707—2014,分別對原料小麥肽和玉米肽進行理化性質分析[16-17]。

1.2.2 肽-金屬螯合物的合成

1.2.2.1 玉米低聚肽-Ca螯合物

配制質量分數為8%的玉米低聚肽水溶液。調節溶液pH=5后,加入一定量無水氯化鈣使玉米低聚肽與無水氯化鈣質量比為8∶1。50 ℃下攪拌反應60 min。冷卻至室溫后,加入4倍體積95%(體積分數)乙醇進行醇沉,靜置過夜。在4 000 r/min下離心20 min后,將沉淀取出置于37 ℃烘箱干燥,得到目標螯合物。

1.2.2.2 小麥低聚肽-Fe螯合物

配制質量分數為5%的小麥低聚肽水溶液。向溶液中加入一定量抗壞血酸使其質量分數為1%。調節溶液pH=5后,加入一定量氯化亞鐵使小麥低聚肽與氯化亞鐵質量比為10∶1。75 ℃下攪拌反應65 min。冷卻至室溫后,加入4倍體積95%乙醇進行醇沉,靜置過夜。在4 000 r/min下離心20 min后,將沉淀取出置于37 ℃烘箱干燥,得到目標螯合物。

1.2.3 抗氧化能力測試

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測定[18]

配制不同質量濃度的樣品水溶液,于96孔板中分別加入200 μL樣品溶液與等體積0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合,室溫避光反應30 min后,測定反應液在517 nm的吸光度(AX1)。將DPPH乙醇溶液替換為無水乙醇作為對照組,將樣品溶液替換為去離子水作為空白組,將無水乙醇與去離子水等體積混合溶液作為溶劑組,進行相似實驗操作,并分別測定各反應液的吸光度(空白組為A01,對照組為A11,溶劑組為AS1)。對樣品DPPH自由基清除率(X1)的計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.3.2 羥自由基清除能力測定[19]

配制濃度為5 mmol/L的水楊酸乙醇溶液、過氧化氫水溶液和硫酸亞鐵水溶液,以及不同濃度的樣品水溶液。分別取100 μL樣品溶液、200 μL水楊酸溶液和200 μL硫酸亞鐵溶液依次加入到2 mL離心管中。加入100 μL過氧化氫溶液啟動反應,搖勻后置于37 ℃水浴。反應1 h后取反應液200 μL加入到96孔板中,測定其在510 nm的吸光度(AX2)。對照組將過氧化氫溶液替換為去離子水啟動反應?？瞻捉M將樣品溶液替換為去離子水,溶劑組將樣品溶液和過氧化氫溶液均替換為去離子水,進行相同實驗操作,分別測定反應液吸光度(空白組為A02,對照組為A12,溶劑組為AS2)。對樣品羥自由基清除率(X2)的計算如公式(2)所示:

(2)

1.2.3.3 還原能力測定[20]

配制0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8),質量濃度10 g/L的鐵氰化鉀水溶液,質量濃度100 mg/mL 的三氯乙酸水溶液和質量濃度1 mg/mL的氯化鐵水溶液,以及不同濃度的樣品水溶液。分別取100 μL磷酸鹽緩沖溶液、鐵氰化鉀溶液和樣品溶液置于2 mL離心管中,搖勻后在50 ℃水浴下保溫。保溫20 min后加入100 μL三氯乙酸溶液。取100 μL 反應液置于96孔板中,加入100 μL去離子水和20 μL氯化鐵溶液,放置10 min后測定反應液在700 nm處吸光度AX3。

1.2.4 螯合物抗過敏活性測試[21]

配制0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.6)和不同濃度的樣品水溶液。取0.5 mL樣品溶液和0.5 mL 500 unit/mL透明質酸酶溶液(醋酸-醋酸鈉緩沖液作溶劑)混合。37 ℃下保溫20 min后,加入0.1 mL 2.5 mol/L氯化鈣水溶液,37 ℃下保溫20 min。加入0.5 mL 0.6 mg/mL透明質酸鈉溶液(醋酸-醋酸鈉緩沖液作溶劑)。37 ℃保溫40 min后,室溫放置10 min。加入0.5 mL去離子水、0.1 mL 5 mol/L 氫氧化鈉水溶液、1 mL新鮮配制乙酰丙酮溶液(3.5 mL乙酰丙酮溶于50 mL 1.0 mol/L碳酸鈉溶液)混合,沸水水浴15 min后立即冰浴10 min,放置室溫10 min后加入1 mL P-DAB試劑(0.8 g對二甲氨基苯甲醛溶于15 mL濃鹽酸和15 mL無水乙醇混合均勻),充分振蕩后加無水乙醇至8 mL,放置30 min顯色。將透明質酸酶溶液和透明質酸鈉溶液均替換為醋酸-醋酸鈉緩沖液作為對照組,將樣品溶液替換為去離子水作為空白組,將對照組中樣品溶液替換為去離子水作為溶劑組,分別測定4組反應液在530 nm下的吸光度(樣品組為Ax4,空白組為A04,對照組為A14,溶劑組為As4)。對樣品透明質酸酶抑制率(X4)的計算如公式(3)所示:

(3)

2 結果與分析

2.1 原料低聚肽理化性質分析

參考QB/T 5298—2018和QB/T 4707—2014及其中國標測試方法,測定了2種低聚肽的理化性質(表1)。由表1可知,2種低聚肽樣品中水分和灰分含量均小于5%,蛋白含量則均高達86%,表明樣品中蛋白含量高。樣品酸溶蛋白含量均超過80%,重均分子量<500,表明2種低聚肽成分多為二肽或三肽,易于被人體消化吸收,適用于進一步的食品加工。

表1 原料低聚肽理化性質參數Table 1 Physicochemical properties of oligopeptides

2.2 螯合物抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH結構中苯環的位阻效應和π-π共軛使其中心氮原子上的不成對電子可穩定存在,形成自由基?？寡趸瘎┑碾娮涌膳c自由基的電子配對進而清除自由基,故采用測定DPPH自由基清除率的方式可評價樣品的抗氧化能力。由圖1可知,底物多肽和相應的螯合物均有很好的DPPH自由基清除能力,實驗最終清除率均可達到84%,但均遠弱于抗壞血酸的DPPH自由基清除能力。利用樣品的DPPH自由基清除率隨濃度變化的曲線可計算樣品的IC50(表2)。玉米肽-Ca螯合物的IC50雖小于玉米肽的IC50,但在最終質量濃度10 mg/mL時玉米肽-Ca螯合物的清除率大于玉米肽本身,質量濃度>1 mg/mL時兩樣品清除率之間也均沒有顯著性差異(P>0.05)。結合清除率隨濃度變化的曲線和顯著性分析綜合判斷,可認為玉米肽與其鈣螯合物的DPPH自由基清除能力基本相同,無還原性鈣離子的加入對玉米肽的DPPH自由基清除能力沒有明顯影響。小麥肽-Fe螯合物的清除率隨濃度增長則明顯快于其他低聚肽或螯合物,其IC50也因此更小,推測原因是螯合物本身帶有的Fe2+具有強還原性,使螯合物在極低濃度下清除率即可達到85%,表明小麥肽-Fe螯合物的DPPH自由基清除能力明顯強于小麥肽本身。

a-玉米肽、小麥肽、玉米肽-Ca;b-小麥肽-Fe;c-抗壞血酸圖1 螯合產物、低聚肽和抗壞血酸的DPPH自由基清除能力Fig.1 The DPPH radical scavenging ability of chelates, oligopeptides, and ascorbic acid

表2 螯合產物、低聚肽和抗壞血酸清除DPPH自由基IC50和實驗最終清除率Table 2 The IC50 value and ending ratio for DPPH radical scavenging of chelates, oligopeptides and ascorbic acid

2.2.2 羥自由基清除能力

羥自由基具有極強的得電子能力,氧化電位為2.8 V,僅次于單質氟,因此常被用于評價樣品的抗氧化能力。如圖2所示,所測樣品中兩類肽-金屬螯合物有較強的羥自由基清除能力,清除率可達80%,但弱于作為對照的抗壞血酸。而用于合成螯合物的原料低聚肽和金屬離子(鈣離子一般無還原性故省略)的清除能力不強,在實驗濃度范圍中清除率未過40%,其中具有強還原性的氯化亞鐵清除率約為11%。利用樣品的羥自由基清除率隨濃度變化的曲線可計算樣品的IC50(表3)。由上述現象,可見低聚肽與金屬離子螯合后其羥自由基清除能力明顯增強,各濃度下螯合物樣品清除率顯著高于單體的清除率(P<0.05)。螯合物客體金屬離子所測得的清除率最低,由此推測實驗中樣品清除羥自由基主要依靠低聚肽結構。螯合物的清除能力強于低聚肽本身,且清除率也大于低聚肽和金屬離子清除率的加和,推測其原因是客體金屬離子與主體低聚肽配位改變了低聚肽的電荷分布,使低聚肽更偏向于負電性,更易向自由基提供電子進而將自由基清除。

a-螯合產物、低聚肽、氯化亞鐵;b-抗壞血酸圖2 螯合產物、低聚肽、氯化亞鐵和抗壞血酸的羥自由基清除能力Fig.2 The hydroxyl radical scavenging ability of chelates, oligopeptides, ferrous chloride, and ascorbic acid

表3 螯合產物、低聚肽、氯化亞鐵和抗壞血酸清除羥自由基IC50和實驗最終清除率Table 3 The IC50 value and ending ratio for hydroxyl radical scavenging of chelate, oligopeptide, ferrous chloride and ascorbic acid

2.2.3 還原能力測試

利用鐵氰化鉀和氯化鐵與樣品產生普魯士藍進行的還原能力測試也是評價抗氧化能力的常見方式。圖3顯示出與圖1類似的現象。玉米肽與其螯合物吸光度隨濃度變化相似,在實驗濃度范圍內吸光度可達0.3～0.4,在約10 mg/mL時吸光度已沒有顯著性差異(P>0.05)。小麥肽-Fe螯合物與氯化亞鐵因其內含有鐵元素,其吸光度可達3.5～4.0,與小麥肽本身(實驗吸光度最大值為0.45)有明顯不同。小麥肽-Fe螯合物與氯化亞鐵兩者實驗最終吸光度沒有顯著性差異(P>0.05),但吸光度增長趨勢發生明顯變化的濃度不同。氯化亞鐵在4 mg/mL開始曲線趨于平緩,而小麥肽-Fe螯合物則在8 mg/mL曲線不再上升,推測該現象是因為相同濃度的兩種樣品中鐵元素濃度不同,氯化亞鐵的鐵元素濃度更大也因此增長趨勢發生明顯變化的濃度較小。也由此推測小麥肽-Fe螯合物的還原能力主要依靠客體亞鐵離子。以具有強還原性的抗壞血酸作為對照,其曲線趨于平緩的濃度遠小于其他樣品,實驗最終吸光度可達0.4,與不含鐵元素的樣品類似。氯化亞鐵和抗壞血酸均是強還原劑,表明4種樣品均有較強的還原能力。

a-玉米肽、小麥肽、玉米肽-Ca;b-FeCl2、小麥肽-Fe;c-抗壞血酸圖3 螯合產物、低聚肽、氯化亞鐵和抗壞血酸的還原能力Fig.3 The reductive ability of chelates, oligopeptides, ferrous chloride, and ascorbic acid

2.3 螯合物抗過敏活性測試

透明質酸酶是一種糖苷酶,其活性與常見的I型過敏反應有很強的相關性[22-23],有文獻表明小分子質量低聚肽具有一定透明質酸酶抑制能力進而獲得了抗過敏活性[24],該法也因此被應用于比較分子抗過敏活性強弱[25]。本文以透明質酸酶抑制率為指標,對小麥肽、玉米肽、玉米肽-Ca螯合物和小麥肽-Fe螯合物的抗過敏活性進行評價。

首先在100 mg/mL,對上述4種樣品進行透明質酸酶抑制實驗,結果如圖4所示。小麥肽的抗過敏活性很高,100 mg/mL的小麥肽透明質酸酶抑制率可達83%。玉米肽也具有一定的抗過敏活性但與小麥肽相比較低,100 mg/mL的玉米肽透明質酸酶抑制率僅有51.79%。在螯合物方面,100 mg/mL的小麥肽-Fe螯合物具有66.07%的透明質酸酶抑制率,相較于同濃度的玉米肽-Ca螯合物表現出更好的透明質酸酶抑制性。進一步,對4種樣品抑制透明質酸酶的量效關系進行研究。由圖4可知,在低質量濃度時(0～20 mg/mL)螯合物與相應低聚肽的抑制率均存在顯著性差異(P<0.05),小麥肽-Fe螯合物、玉米肽-Ca螯合物抑制率可分別達到25.86%、44.83%,與小麥肽和玉米肽(均小于10%)相比具有更好的透明質酸酶抑制性。中高質量濃度時(20～100 mg/mL)小麥肽和玉米肽對透明質酸酶的抑制率隨濃度的變化出現了明顯的增大趨勢:在100 mg/mL,玉米肽與玉米肽-Ca螯合物的抑制率已無顯著性差異(P>0.05),小麥肽的抑制率則已顯著高于小麥肽-Fe螯合物(P<0.05)。然而兩種螯合物的抑制率在中高濃度區間的增長則趨于平緩。不同濃度范圍下螯合物和低聚肽對透明質酸酶抑制率的增長趨勢有明顯區別,螯合物在低濃度時已經具有相對較高的透明質酸酶抑制活性,而低聚肽本身則需要更大的濃度獲得相同的抑制活性。

圖4 螯合產物、低聚肽對透明質酸酶抑制活性Fig.4 Hyaluronidase inhibition activity of chelates and oligopeptides

3 結論

本文利用DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原能力三類指標,對樣品的抗氧化能力進行評價。實驗表明玉米肽、小麥肽、玉米肽-Ca螯合物和小麥肽-Fe螯合物均有很強的還原能力和DPPH自由基清除能力,其中小麥肽-Fe螯合物因含有亞鐵離子表現尤甚。在羥自由基清除能力的測試中,螯合物則明顯強于低聚肽和螯合所用鹽,證明螯合物的抗氧化能力并非是簡單的單體疊加而是依靠了螯合的工藝。此外,利用透明質酸酶抑制法對相同樣品的抗過敏活性進行測試,樣品在低濃度范圍內的實驗結果與羥自由基清除實驗近似,均是螯合物的能力強于低聚肽,由此可推測物質的抗氧化能力與抗過敏活性存在一定的正相關聯系;在中高濃度范圍內低聚肽的抑制能力增長則明顯快于螯合物,這種抑制率增長趨勢隨濃度變化而變化的現象可應用于樣品抗過敏活性的進一步精細研究。

鐵和鈣是人體必需的元素,中國營養學會推薦成人的每日鈣攝入量800 mg,攝入過量則會增加動脈斑塊堆積和心臟損傷等風險[26];推薦成年男性攝入鐵元素12 mg,成年女性攝入鐵元素20 mg,攝入過量會引發肝纖維化、肝癌等疾病[27]。因此市面上的食品和藥品中鐵和鈣元素的含量需嚴格控制,應處于低濃度范圍。本文中的抗氧化能力和透明質酸酶抑制測試說明小麥肽-Fe螯合物和玉米肽-Ca螯合物在低濃度(0～20 mg/mL)時已經具有較高的抗氧化能力和抗過敏活性,表明兩類螯合物在抗過敏、抗氧化食品藥品方向具有廣闊的發展前景和巨大的應用潛能。