航天誘變腸膜明串珠菌胞外多糖的分離純化、結構解析及功能活性研究

彭嘉屹,李堯,張孟雨,王清清,鐘青萍

(廣東省食品質量與安全重點實驗室,華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外環境中或結合在菌體表面的一類糖類化合物[1]。乳酸菌產生的EPS能夠改變發酵產品的外觀、流變特性、質地和口感,因此它們可作為增黏劑、穩定劑、乳化劑或膠凝劑運用到食品工業中,其還可作為生物絮凝劑、生物吸收劑、離子交換樹脂和重金屬去除劑用于化妝品、制藥行業和環境保護[2-3]。由于乳酸菌生產的生物聚合物不會對健康造成危害,通常被認為是安全的[4]。越來越多的研究表明乳酸菌EPS在改善人類健康中具有多種功能作用,包括免疫調節、抗癌、抗氧化、抗潰瘍、預防病原菌的生物被膜黏附、降血糖、降膽固醇和抗高血壓等[5-8]。

航天誘變技術是利用搭載衛星、火箭等返回式航天器將菌株搭載到宇宙空間中,使其在太空因子的作用下,如強輻射、微重力、高真空、交變磁場、超凈環境等來改變菌株自身的基因,使得菌株的遺傳性狀發生改變,從而獲得有益突變,再對其進行深入研究,進行新產品的開發利用[9]。近年來,我國利用航天誘變技術對微生物進行誘變,得到了許多性狀優良的菌株。因此,利用航天誘變技術獲得菌株新特性具備較高的可行性[10-11]。

前期實驗中通過航天誘變篩選出一株具有較好活性的腸膜明串珠菌L21-49,基于此,本研究首先采用離子交換層析和分子篩層析對其產生的EPS進行分離純化,然后采用凝膠滲透色譜、紅外光譜、液相色譜對純化后EPS組分進行結構解析,并分析多糖對2種常見病原菌的抗生物被膜活性、體外抗氧化活性、對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。研究結果為擴大乳酸菌的綜合利用,以及使其EPS成為一種多功能活性物質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸膜明串珠菌L21-49由本實驗從經航天誘變的腸膜明串珠菌L16的誘變菌株中分離、純化并經16S rRNA鑒定,保藏于-80 ℃冰箱。

胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉,廣東環凱微生物科技有限公司;DEAE-Sepharose Fast Flow、Sepharose CL-6B、透析袋、Tris,北京索萊寶科技有限公司;三氯乙酸,天津市福晨化學試劑有限公司;DPPH試劑、ABTS試劑,美國sigma公司;黃嘌呤氧化酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸(p-Nitrophenyl β-D-Glucuronide,pNPG),深圳文樂生物科技公司;α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶,上海吉至生化科技有限公司;其他試劑均為分析純。

YXQ-LS-50A 全自動高壓滅菌鍋,上海博迅實業有限公司醫療設備廠;Scientz-12 N 冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;PL602-S電子分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;PHS-25 pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;1285生物安全柜,美國Thermo Electron公司;VersaMax 光柵型酶標儀,美國Melecular Devices公司;Evolution 300 紫外可見分光光度計、Nicolet IS 50/6700傅里葉變換紅外光譜儀,美國ThermoFIsher Scientific公司;LC-20AD 高效液相色譜儀,日本島津公司;R1001-VN 旋轉蒸發儀,鄭州長城科工貿有限公司;150A恒溫培養箱,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;Agilent1260 凝膠滲透色譜,美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要培養基和溶液的配制

MRS培養基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏5.0,酵母粉4.0,葡萄糖20.0,吐溫80 1.0 mL,磷酸氫二鉀1.52,乙酸鈉3.53,檸檬酸三銨2.0,硫酸鎂0.2,硫酸錳0.03,pH 6.0。121 ℃ 滅菌20 min。

LB 培養基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

0.1 mol/L PBS溶液(pH=6.86):A液(0.2 mol/L Na2HPO4):稱取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于1 L水中;B液(0.2 mol/L NaH2PO4):稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O溶于1 L水中。取49 mL A液和51 mL B液混合配成pH=7.4的緩沖液,取500 mL加超純水稀釋至1 000 mL。

ABTS陽離子工作液:7.4 mmol/L ABTS與等體積2.6 mmo/L K2S2O8混合后于黑暗條件下靜置12 h,使用前用pH 7.4的PBS稀釋,使其OD734nm值為0.7±0.2。

α-淀粉酶溶液、α-葡萄糖苷酶溶液:使用PBS緩沖鹽溶液將α-淀粉酶溶液、α-葡萄糖苷酶溶液分別配制成1 U/mL后避光保存于-20 ℃,使用前放置于40 ℃水浴鍋中預熱30 min。

1.2.2 腸膜明串珠菌EPS的分離純化

1.2.2.1 EPS的提取

參考盧承蓉等[12]的方法并略作修改。將腸膜明串珠菌L21-49按3%接種量接種于MRS培養基中,在37 ℃恒溫靜置培養24 h,連續活化3次后,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,棄菌體沉淀,取上清液加入80%(質量分數)三氯乙酸溶液,使溶液中三氯乙酸終質量濃度為4 g/L,在4 ℃冰箱中靜置6～8 h后,4 ℃、10 000 r/min離心15 min,棄去蛋白質沉淀,取上清液加入自身3倍體積的95%(體積分數)乙醇,在4 ℃冰箱中靜置12～15 h后4 ℃、10 000 r/min離心15 min即得多糖沉淀。多糖加入去離子水溶解后移至透析袋(截留分子質量8 000～14 000 Da)中,用去離子水透析3 h后換水,之后每隔8 h換一次水,持續2 d,收集透析液,真空冷凍干燥,即得到粗多糖。

1.2.2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析

參考李堯等[13]的方法并略作修改。用55 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.5～7.8)以1 mL/min平衡DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱(2.6 cm×58 cm),平衡3個柱體積,200 mg粗多糖溶于4 mL Tris-HCl溶液中,0.22 μm濾頭過濾后上樣。以Tris-HCl和含有0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液進行梯度洗脫,流速為1 mL/min,每8 min收集一管洗脫液,每管采用苯酚-硫酸法[14]檢測多糖含量,測定其OD490nm值。以管數為橫坐標,OD490nm值為縱坐標,作洗脫曲線。根據洗脫曲線收集主峰,減壓旋轉蒸發濃縮,超純水透析2 d,真空冷凍干燥。

1.2.2.3 Sepharose CL-6B 分子篩層析

Tris-HCl溶液以1 mL/min平衡Sepharose CL-6B層析柱(2.6 cm×60 cm),平衡3個柱體積,取經陰離子交換柱層析后的多糖樣品100 mg溶于2 mL Tris-HCl中,0.22 μm濾頭過濾后上樣。以Tris-HCl溶液進行洗脫,流速為1 mL/min,每8 min收集一管洗脫液,每管采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量,測定其OD490nm值。以管數為橫坐標,OD490nm值為縱坐標,作洗脫曲線。根據洗脫曲線收集主峰,減壓旋轉蒸發濃縮,超純水透析2 d,真空冷凍干燥,即得到純化EPS。

1.2.3 腸膜明串珠菌EPS純化組分的基本組成分析

1.2.3.1 紫外光譜分析

通過紫外分光光度計將1.00 mg/mL純化EPS溶液進行200～800 nm全波段掃描,檢測純化EPS在260、280 nm和400～700 nm處是否含有核酸、蛋白質和色素的特征吸收峰。

1.2.3.2 總糖、蛋白質、硫酸根、糖醛酸含量測定

采用硫酸-苯酚法,通過繪制葡萄糖標準曲線測定純化EPS的總糖含量;使用索萊寶蛋白質含量試劑盒,通過繪制蛋白質含量標準曲線測定純化EPS的蛋白質含量;采用氯化鋇-明膠比濁法,通過繪制硫酸根含量標準曲線測定純化EPS的硫酸根含量[15];采用硫酸-咔唑法,通過繪制糖醛酸含量標準曲線測定純化EPS的糖醛酸含量[16]。

1.2.4 腸膜明串珠菌EPS純化組分的結構分析

1.2.4.1 相對分子質量測定

采用水相凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)測定純化后EPS的分子質量。用超純水配制質量濃度為1.00 mg/mL的樣品溶液,0.22 μm 濾膜過濾后進行GPC檢測。采用不同相對分子質量的標準葡聚糖制作標準曲線,通過Breeze軟件進行數據分析,確定其平均分子質量。

GPC色譜條件:采用Waters 2414示差折光檢測器;PL aquqgel-OH MIXED 8 μm(250 mm×4.6 mm)色譜柱,0.2 mol/L NaNO3和0.01 mol/L NaH2PO4(pH 7.0)為流動相,柱溫30 ℃,進樣量40 μL,流速1 mL/min進行洗脫。

1.2.4.2 紅外光譜測定

取干燥至恒重的純化EPS與干燥的KBr以質量比1∶50研磨、壓片,利用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進行掃描。

1.2.4.3 單糖組成分析

精密稱取甘露糖,核糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,N-乙酰-氨基葡萄糖,葡萄糖,N-乙酰-氨基半乳糖,半乳糖,木糖,阿拉伯糖,巖藻糖對照品適量,加水溶解稀釋至每1 mL中各含50 μg的混合對照溶液。另取約3.0 mg純化多糖、3.0 mL 2 mol/L三氟乙酸于10 mL安瓿瓶中,封管,120 ℃酸解4 h,取出加入甲醇,氮吹揮干三氟乙酸,加3.0 mL水復溶。精確吸取250 μL混合對照溶液和水解后的純化EPS溶液至5 mL EP管中,加入250 μL 0.6 mol/L NaOH,500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(溶于甲醇),70 ℃反應1 h。冷水中冷卻10 min;加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和,再加入1 mL氯仿渦旋1 min,3 000 r/min離心10 min,小心取上清液,萃取3次后采用高效液相色譜儀分析。

分析條件:采用Xtimate C18 (4.6 mm×200 mm)5 μm色譜柱,以V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=83∶17為流動相,柱溫30 ℃,進樣量20 μL,檢測波長250 nm,流速1.0 mL/min進行洗脫。

1.2.5 腸膜明串珠菌EPS純化組分的功能活性測定

1.2.5.1 抗致病菌生物被膜活性的測定

參考WANG等[17]的方法稍作修改。將金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以2%的接種量接種至LB培養基中,37 ℃、150 r/min活化兩代后,用新鮮LB培養基稀釋至106CFU/mL,取100 μL稀釋后的菌液加入到96 孔板中,另取 0.5、1、2、4、8 mg/mL 100 μL純化EPS加入96孔板中,37 ℃恒溫靜置培養24 h,用無菌水作為對照。采用結晶紫染色法測定純化EPS對致病菌生物被膜形成的抑制率[18]。

1.2.5.2 抗氧化活性的測定

參考李堯等[13]的方法測定純化EPS對DPPH自由基、羥自由基(·OH)、ABTS陽離子自由基和超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力;參考WANG等[19]的方法測定純化EPS的總還原能力。

1.2.5.3 對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的測定

參考WANG等[20]的方法測定純化EPS對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。

1.3 數據分析

試驗涉及的數據均重復3次或3次以上,采用IBM SPSS Statistics 25對數據進行統計分析,以P<0.05表示數據具有統計學差異,采用GraphPad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1 EPS的分離純化

乳酸菌EPS粗提物中通常含有帶不同電荷、不同分子質量的EPS,以及一些小分子雜質,為混合物,需要對其進一步分離純化。DEAE-Sepharose Fast Flow屬于陰離子交換劑,分辨率高,適用于大劑量樣品分離出中性、酸性多糖[21]。如圖1所示,L21-49的EPS粗提物經不同濃度的Tris-NaCl(0～0.7 mol/L)洗脫后共得到EPS-A、EPS-B、EPS-C和EPS-D 4個多糖組分,將其對應管數收集,透析、冷凍干燥之后稱重,得率分別為21.15%、14.00%、10.28%和3.68%。其中用Tris-HCl洗脫可以得到EPS-A,為中性多糖;用不同濃度的Tris-NaCl洗脫可以得到EPS-B、EPS-C和EPS-D,這3種多糖組分都帶有電荷,為酸性多糖。由于EPS-D得率太低,后續主要研究EPS-A、EPS-B和EPS-C。

圖1 L21-49的EPS粗提物的DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析Fig.1 The DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatogram of the crude EPS of L21-49

經離子交換層析純化后獲得不帶電荷和帶電荷性質相近的EPS組分,由于其分子質量大小可能不同,因此還需通過Sepharose CL-6B分子篩進一步分離純化。Sepharose CL-6B具有化學穩定性高、重復性好、流速快等優勢。如圖2所示,用Tris-HCl對L21-49的3種純化組分進行洗脫,3種組分的洗脫曲線都能得到比較對稱的單一峰,表明這3種純化EPS組分為分子質量大小均一的單一組分。將EPS-A、EPS-B和EPS-C對應管數收集,透析、冷凍干燥之后稱重,得率分別為57.20%、54.79%和59.20%。

a-EPS-A;b-EPS-B;c-EPS-C圖2 EPS-A、EPS-B、EPS-C的Sepharose CL-6B分子篩層析Fig.2 The Sepharose CL-6B exclusion chromatography for EPS-A, EPS-B, and EPS-C

2.2 EPS純化組分的基本組成分析

2.2.1 紫外光譜分析

使用紫外可見分光光度計對不同的EPS樣品進行紫外-可見(200～800 nm)全波長掃描,吸收光譜如圖3所示。各純化組分在260 nm處沒有吸收峰;EPS-A和EPS-B在280 nm處無吸收峰,而EPS-C在280 nm處出現了微弱吸收峰,可能其含有少量的蛋白質,為糖-蛋白體系。各組分在可見光波長都沒有出現吸收峰,表明都不含有色素。綜上所述EPS-A、EPS-B和EPS-C基本不含有核酸、蛋白質和色素,分離效果好,較為純凈。

a-EPS粗提物;b-EPS-A;c-EPS-B;d-EPS-C圖3 EPS粗提物和各純化EPS的紫外-可見吸收光譜Fig.3 The UV-Vis spectra of the crude EPS and the purified EPSs

2.2.2 總糖、蛋白質、硫酸根、糖醛酸含量

通過實驗獲得葡萄糖含量標準曲線方程為Y=0.006 9X+0.084 5(R2=0.999),蛋白質含量標準曲線方程為Y=1.669 0X+0.593 2(R2=0.990),硫酸根含量標準曲線方程為Y=0.187 4X+0.084 9(R2=0.993),糖醛酸含量標準曲線方程為Y=5.667 0X+0.158 8(R2=0.990)。純化EPS的總糖、蛋白質、硫酸根、糖醛酸含量如表1所示。本研究中L21-49的純化EPS的總糖含量高于粗多糖,但硫酸根和糖醛酸含量卻比粗多糖低。EPS-A和EPS-B的硫酸根及糖醛酸含量都低于EPS-C,與周佳敏[22]分離純化的一株鼠李糖乳桿菌結果類似,由此可見酸性多糖不同帶電量應該與硫酸根、糖醛酸含量以及其所處環境等有關。

表1 L21-49 的EPS的基本組成 單位:%

2.3 EPS純化組分的結構分析

2.3.1 相對分子質量測定

純化EPS相對分子質量的GPC色譜圖如圖4所示,3種純化EPS經 GPC 洗脫后第1個峰峰形尖銳對稱,表明得到的EPS較為純凈,分子質量均一。利用Brezze軟件分析3種純化EPS的分子特征,如表2所示。

表2 純化EPS的分子特征Table 2 The molecular characteristics of the purified EPSs

a-EPS-A;b-EPS-B;c-EPS-C圖4 EPS-A、EPS-B、EPS-C的GPC圖譜Fig.4 The gel permeation chromatograms of EPS-A, EPS-B, and EPS-C

當多分散性系數(polymer dispersity index,PDI,Mz/Mw)小于3時,表明分子質量分布范圍較為均一[23],也有研究表明,PDI作為衡量EPS 分子質量分布寬度的指標,對EPS功能性質具有顯著影響[24]。EPS的分子質量在很大程度上影響其理化、生理甚至生物學性質。EPS一些生物活性如抗菌和降低膽固醇與分子質量呈正相關,有研究表明高分子質量EPS對革蘭氏陽性菌的抗菌作用比低分子質量EPS更強[25]。但EPS分子質量與免疫調節和抗腫瘤活性之間是否存在關系尚沒有確定的結論[19]。

2.3.2 紅外光譜測定

a-EPS-A;b-EPS-B;c-EPS-C圖5 EPS-A、EPS-B、EPS-C的紅外光譜圖Fig.5 The infrared spectra of EPS-A, EPS-B, and EPS-C

EPS的分子骨架,從連接方式(α/β和1→3、4、6)到成分組成(異構體和官能團)都可以顯著影響它們的物理化學和生物學特性[29]。(1→4)主鏈連接方式賦予比(1→2)和(1→3)更大的剛度,因此在EPS抗氧化活性中可以通過這種剛性結構將大量半縮醛羥基暴露于環境自由基分子中[30]。羧基這種官能團可以發揮協同作用,一方面它們可以提供更多的孤對電子以加強分子間氫鍵相互作用,從而顯示出高黏度、抗菌和降膽固醇活性,另一方面,這些負基團可以為EPS創造酸性環境,以促進其水解以暴露更多的半縮醛羥基,從而顯示出優異的抗氧化活性[31]。

2.3.3 單糖組成分析

如表3所示,3種多糖均含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖,但組成的比例不同。EPS-A主要含有甘露糖和葡萄糖,EPS-B主要含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸,EPS-C單糖組成較多,主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖組成。

表3 純化EPS的單糖組成 單位:%

2.4 EPS純化組分的功能活性測定

2.4.1 抗致病菌生物被膜活性的測定

結果如圖6所示,質量濃度為8.0 mg/mL時,EPS-A、EPS-B、EPS-C對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率分別為51.58%、62.24%、47.33%;但是EPS-A、EPS-B、EPS-C對單增李斯特菌生物被膜的抑制率分別為34.57%、55.96%、30.58%?？傮w來看,3種純化EPS都表現出一定的抑制活性,EPS-B對兩種菌生物被膜的抑制效果始終優于EPS-A和EPS-C。KANMANI等[32]研究表明乳酸鏈球菌EPS可以抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的生物被膜形成,其在1 mg/mL 時對單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率超過67%。

a-金黃色葡萄球菌;b-單增李斯特菌圖6 純化EPS的抗致病菌生物被膜活性Fig.6 The anti-biofilm activities of the purified EPSs

對于乳酸菌EPS抗致病菌生物被膜的研究相對較少,有研究顯示添加EPS可以降低致病菌細胞表面疏水性、zeta電位和細胞間相互作用,從而抑制生物被膜的形成,然而具體的抑制機制尚未闡明[33]。在本研究中,L21-49的3種純化EPS對于兩種致病菌生物被膜抑制率均呈現EPS-B>EPS-A>EPS-C,生物被膜抑制活性的差異可能是由于不同EPS的電荷、分子質量和結構不同引起的,推測中等分子質量并帶有少量電荷的EPS對生物被膜具有較好的抑制活性。BAI等[34]研究也表明乳酸菌EPS在質量濃度為4.00 mg/mL時對單增李斯特菌生物被膜也具有較好的抑制活性,且EPS可能對細菌細胞表面的修飾、初始細胞附著的抑制或下調參與生物被膜形成的基因表達具有潛在的影響。乳酸菌EPS抑制生物被膜的機制還需要更加深入的研究。

2.4.2 抗氧化活性的測定

a-DPPH自由基;b-·OH;c-ABTS陽離子自由基;總還原力圖7 純化EPS的抗氧化活性Fig.7 The antioxidant activities of the purified EPSs

EPS體外抗氧化的分子機制在于這些生物大分子在酸性環境中發生水解,產生大量活潑的半縮醛羥基,同時將電子傳遞給反應體系中的自由基,促進自由基向穩定物質的轉化,最終降低自由基的濃度[31]?？寡趸阅芘c分子質量有很大關系,如前所述,這些聚合物的抗氧化活性取決于半縮醛羥基的數量,同時分子質量越低,在同等質量濃度下暴露的半縮醛羥基越多,因此,抗氧化活性隨著分子質量的降低而提高。本研究中3種純化EPS分子質量從高到低依次為EPS-A、EPS-B和EPS-C,根據糖醛酸含量和單糖組成分析結果,EPS-A基本不含葡萄糖醛酸,EPS-C的葡萄糖醛酸含量高于EPS-B,預測抗氧化活性EPS-C>EPS-B>EPS-A,從后續實驗中也驗證了這個結果,EPS-C的高抗氧化活性也有可能與其含有硫酸鹽有關。

2.4.3 對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,可以降低食物在腸道內水解成葡萄糖的速度,從而降低血液中的葡萄糖含量[37]。如圖8所示,L21-49的3種純化EPS在0.5～1.0 mg/mL時對α-淀粉酶發揮濃度依賴性抑制作用,其對α-淀粉酶的最大抑制率分別為25.60%、27.55%、17.78%。WANG等[20]研究表明樺褐孔菌胞外多糖UIOPS-1I在0.2 mg/mL質量濃度下對α-淀粉酶的抑制率為37.96%。3種純化EPS在0.5～8.0 mg/mL對α-葡萄糖苷酶發揮濃度依賴性抑制作用,最大抑制率分別為32.19%、20.41%、22.80%。

a-α-淀粉酶;b-α-葡萄糖苷酶圖8 純化EPS對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.8 The inhibitory activities of the purified EPSs on α-amylase and α-glucosidase

EPS-A相較于EPS-B和EPS-C來說具有較高的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,且隨著EPS濃度的增加,對α-淀粉酶的抑制率不再上升,說明EPS對α-淀粉酶的活性抑制作用有飽和效應,而對于α-葡萄糖苷酶也具有一定的濃度依賴性。JIANG等[37]通過α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究發現,乳酸菌EPS對兩種酶的抑制作用均為可逆的競爭性抑制。

3 結論