不同假小鏈雙歧桿菌對碳水化合物利用能力的比較研究

李劉若蘭,張程程,劉秉書,于雷雷,田豐偉,陳衛,翟齊嘯

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

假小鏈雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)在各個年齡段人群中普遍存在,是中國人群腸道中的優勢雙歧桿菌[1]。據報道腸道中長雙歧桿菌和假小鏈雙歧桿菌在中國兒童[2]、成年人[3]以及健康老人[4]的腸道中占據了豐度優勢。研究發現,假小鏈雙歧桿菌能調節胰島素抵抗肥胖兒童的炎癥狀態和血脂水平[5]、改善肥胖表型[6]。假小鏈雙歧桿菌C95[7]、MY40C和CCFM680[8]菌株能改善葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠的疾病表型。在食品工業的應用上,假小鏈雙歧桿菌通過分泌植酸酶[9]、β-葡萄糖苷酶從而提高人體對面包礦物質、對異黃酮的利用率,展現了作為食品發酵劑的潛力。

發酵碳水化合物是腸道中大部分細菌所必須的代謝過程[10]。雙歧桿菌對碳水化合物的利用一直以來是研究的重點,雙歧桿菌能利用多種膳食來源的寡糖,如:低聚果糖(fructooligosaccharide,FOS)、低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)、低聚木糖等,以及母乳寡糖和少數淀粉類多糖[11]。與碳水化合物利用相關的基因在雙歧桿菌基因組中的比例為12%～14%,高于其他腸道菌群的比例[12],這使得它們可以代謝各種宿主無法消化的碳水化合物,從而能夠為雙歧桿菌的定殖提供優勢。人的腸道中含有大量復雜的碳水化合物,而這些不被人體消化的寡糖或多糖最終會成為腸道菌群的底物。通過競爭有限的碳源,這些腸道菌群得以存活和定殖。

MILANI研究發現,構成雙歧桿菌的主要碳源代謝途徑“Bifid Shunt”的基因屬于核心基因組,許多碳水化合物利用基因具有物種特異性[13]。假小鏈雙歧桿菌具有豐富的碳水化合物代謝基因結構,可利用大豆異黃酮苷[14]降解復雜植物多糖等[15]。長雙歧桿菌長亞種能專門代謝成人飲食中發現的特定植物聚糖,大量的文獻也揭示了雙歧桿菌對母乳寡糖的利用[15]。但在過往的報道中,大多數研究都集中在單株假小鏈雙歧桿菌上,缺少對假小鏈雙歧桿菌碳水化合物利用的整體研究。

了解不同假小鏈雙歧桿菌菌株對碳水化合物的利用及差異,找到對其具有促生長作用的碳水化合物從而提高在人腸道中的豐度,找到碳水化合物利用能力較強的假小鏈雙歧桿菌菌株,有助于確定不同種類的碳水化合物如何搭配合適的合生元配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細菌菌株

本研究使用的12株來自人體的假小鏈雙歧桿菌信息如表1所示。

表1 實驗菌株信息Table 1 Strains information

1.1.2 實驗試劑

低聚半乳糖,新金山生物科技股份有限公司;菊粉,上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖、乳糖、木糖、D-半乳糖、蔗糖、D-麥芽糖、甘露糖、海藻糖、低聚果糖、D-果糖,D-阿拉伯糖,纖維二糖、甘露醇,L-鼠李糖,可溶性淀粉以及mMRS中的其他化學品,國藥集團化學試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,中國北京天根生物技術有限公司;糞便基因組提取試劑盒,美國MP公司。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋SX-500,日本Tomy Digital Biology公司;厭氧工作站AW500SG DG250,英國Etectrotek公司;酶標儀MULTISCAN GO,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;全自動酶標儀Infinite F50,瑞士Tecan公司;超低溫冰箱Thermo-994,美國Thermo Fisher科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基及試劑配制

參考文獻方法[16]配制mMRS培養基。

不同碳源培養基:配制不含葡萄糖的mMRS液體培養基。將菊粉、乳糖、D-半乳糖、蔗糖、L-鼠李糖、葡萄糖、D-麥芽糖、木糖、纖維二糖、FOS、GOS、甘露糖、D-阿拉伯糖、海藻糖、D-果糖、甘露醇和可溶性淀粉等17種碳源制成濃度為1 g/10 mL的糖液經濾膜過濾后加入無糖mMRS中,使糖終濃度為10 g/L。

溴甲酚紫母液的配制:使用無水乙醇溶解,用水定容(如配制20 mL 0.5%溴甲酚紫溶液,將0.1 g固體溴甲酚紫稱于50 mL離心管中,加入4 mL無水乙醇溶解,反復吹打,定容至20 mL,1 L培養基中加入15 mL母液)。

體外發酵GMM培養基:參考GOODMAN等[17]的方法配制GMM培養基并進行體外發酵實驗,參考LIKOTRAFITI等[18]的方法確定接種量為109CFU/mL活菌。

1.3.2 碳水化合物利用實驗

1.3.2.1 菌株活化與培養

將冷藏于-80 ℃的保菌管取出,于厭氧工作站中培養18～24 h,37 ℃,活化2～3代后開始實驗。菌株培養后,取1 mL菌液,8 000 r/min離心5 min,等體積無菌生理鹽水重懸。

1.3.2.2 實驗菌株的碳源利用能力測定

參考文獻方法[19]進行碳源利用能力測定。在不同碳源培養基中加入溴甲酚紫溶液,將菌液按接種量1%加入96孔板中,培養24 h,每隔2 h觀察記錄一次顏色變化,若顏色由紫變黃,即pH≤5.2,則說明該菌株可以利用該碳源進行代謝。

1.3.2.3 實驗菌株在不同碳源培養基中代時的測定

參考文獻方法[16]進行代時的測定。代時計算如公式(1)所示:

(1)

式中:G表示雙歧桿菌的生長代時;A0表示進入對數生長期時菌株的初始吸光度;At表示t時刻雙歧桿菌吸光度。

1.3.2.4 實驗菌株在不同碳源培養基中吸光度OD600值的測定

以1%的接種量將菌懸液分別接種到各種碳源培養基中,37 ℃厭氧培養48 h取出,利用酶標儀測定OD600值。以葡萄糖為碳源的mMRS和去糖mMRS作為陽性和陰性實驗組。

1.3.3 雙歧桿菌在人糞便體外發酵培養基中的生長情況測定

將各菌株接入GMM培養基后,置于厭氧工作站中分別孵育0、24 h,結束后取出置于冰上15 min終止發酵,轉移至-80 ℃保存備用。測試之前放于冰上解凍,樣品經過10 000×g、4 ℃離心10 min后,取沉淀使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA用于定量PCR,通過絕對定量分析糞便中雙歧桿菌的豐度變化。

1.3.3.1 糞便基因組提取

快速糞便基因組提取試劑盒用于從糞便樣本中提取細菌基因組DNA,糞便基因組DNA提取方法參考肖越[20]的實驗方法進行。

1.3.3.2 雙歧桿菌的絕對定量

參考文獻方法[20]進行標準曲線構建及絕對定量操作。假小鏈雙歧桿菌的種特異性引物[21](BiCAT-1:CGGATGCTCCGACTCCT,BiCAT-2:CGAAGGCTTGCTCCCGAT,序列5′-3′,退火溫度65 ℃,產物長度285 bp)。簡述定量PCR反應體系與擴增程如下:20 μL體系,2×supermix(BIO-RAD)10 μL,DNA模板2 μL,上下游引物各2 μL,ddH2O(PCR級水)4 μL。擴增程序為:95 ℃,2 min;95 ℃、5 s,65 ℃、30 s;建立融解曲線:65～95 ℃以0.5 ℃增量且2～5 s/步,進行30個循環,95 ℃聚合酶激活和DNA變性5 min。得到Cq值。根據計數結果、稀釋倍數、Cq值就可以繪制出lg(CFU)-Cq值標準曲線。將糞便原始DNA進行qRT-PCR實驗得到的Cq值代入標準曲線曲即可得到糞便中所求菌種的CFU數量。

1.4 數據處理

該論文中實驗均進行3次重復實驗,數據顯示為每組的平均值±標準偏差。使用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗來考察各組平均值的差異。P<0.05用于確定統計顯著性。GraphPad Prism 9.4用于所有統計分析。

2 結果與分析

2.1 實驗菌株的碳源利用能力

測定了12株假小鏈雙歧桿菌對17種碳水化合物的利用情況,實驗結果如表2所示?？芍?2株假小鏈雙歧桿菌均不利用D-阿拉伯糖、甘露糖、L-鼠李糖和可溶性淀粉,均利用葡萄糖、乳糖、FOS、GOS和菊粉,僅有1株菌利用甘露醇、纖維二糖。有50%～91.67%的假小鏈雙歧桿菌能夠利用D-半乳糖、木糖、D-果糖、D-麥芽糖及蔗糖。實驗結果顯示12株假小鏈雙歧桿菌對17種碳水化合物的利用具有株間差異,某些菌株能利用10種以上碳水化合物,而某些菌株僅能利用5種。

表2 假小鏈雙歧桿菌對17種碳水化合物的利用能力Table 2 Utilization abilities of 17 carbon sources by B.pseudocatenulatum

有研究[16]檢測了30株假小鏈雙歧桿菌的碳水化合物利用情況,結果顯示,90%以上的菌株能利用葡萄糖、乳糖、GOS、FOS,與本研究結果一致。另外,該文章還報道了假小鏈雙歧桿菌對植物來源的碳源利用能力強于兩歧雙歧桿菌,但對于宿主來源的碳源(如粘蛋白、2′巖藻糖基乳糖等)利用能力不如兩歧雙歧桿菌。

2.2 實驗菌株在不同碳源培養基中的生長情況

12株假小鏈雙歧桿菌在不同碳源培養基中的生長情況也顯示出碳源利用的差異性。由圖1可知,12株假小鏈雙歧桿菌在9種碳源培養基中的生長曲線具有差異性,除FJSNT37M5外其他菌株對葡萄糖的利用良好(圖1-a),在接種1 250 min后,FJSNT37M5的OD600值僅達到0.39。菌株在不同培養基中的延滯期大部分為480 min左右,但個別菌株延滯期很長,如FJSNT36M3(900 min,圖1-b;780 min,圖1-c;),FAHBZ2M3(870 min,圖1-c;780 min,圖1-d;750 min,圖1-i),FJSNT37M5(900 min,圖1-d;990 min,圖1-f;900 min,圖1-g),A14(990 min,圖1-d;990 min,圖1-f;960 min,圖1-g),FHNBA14M1(780 min,圖1-i),FFJND17M1(870 min,圖1-i),FXJWS49M21(990 min,圖1-i)等,延滯期的差異體現了菌株對環境適應能力的不同。

a-葡萄糖培養基;b-GOS培養基;c-FOS培養基;d-菊粉培養基;e-乳糖培養基;f-木糖培養基;g-麥芽糖培養基;h-D-半乳糖培養基;i-蔗糖培養基圖1 假小鏈雙歧桿菌在9種碳源培養基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of B.pseudocatenulatum in 9 kinds of carbon source media注:每株菌N=3

有研究[22]結果顯示,2株兩歧雙歧桿菌960 min后才進入對數期,4株鏈球菌120 min后即進入對數期。另外,12株假小鏈雙歧桿菌在24 h內的生長速度、生長量也有顯著差異,具體情況如下。

在生長曲線中,延滯期后的一段細胞數以幾何級數增長的時期為指數期,細菌在指數期生長速率最大,代時最短,本研究把細菌在指數期時的代時計算出來如圖2所示。12株假小鏈雙歧桿菌在每種碳源培養基中的代時中位數分別為156.15、144.87、155.86、166.11、180.88、337.53、155.93、382.08、137.61 min。結果顯示,每株雙歧桿菌在不同碳源培養基中表現出生長速率的差異性,A14在木糖和麥芽糖培養基中的代時最短(圖2-g,圖2-f,P<0.05),FGSYC12M4在葡萄糖、木糖、麥芽糖和D-半乳糖培養基中的代時最短(圖2-a、圖2-f、圖2-g、圖2-h、P<0.05),FXJWS49M35在GOS、FOS、乳糖、木糖培養基中代時較長(圖2-b、圖2-c、圖2-e、圖2-f、P<0.05),FXJWS49M33在FOS、菊粉、D-半乳糖培養基中代時較長(圖2-c,圖2-d,圖2-h,P<0.05)。

a-葡萄糖培養基;b-GOS培養基;c-FOS培養基;d-菊粉培養基;e-乳糖培養基;f-木糖培養基;g-麥芽糖培養基;h-D-半乳糖培養基;i-蔗糖培養基圖2 假小鏈雙歧桿菌在不同碳源培養基中的代時Fig.2 Generation time of B.pseudocatenulatum in different carbon source media注:每株菌N=3,不同字母 (a～l) 表示不同組之間存在顯著差異(P<0.05)

有研究報道了假小鏈雙歧桿菌FGSZY20M1在GOS、FOS、葡萄糖培養基中的代時分別為110、150、100 min,與本研究測得數據相近,另外,研究還檢測了短雙歧桿菌在上述3種培養基中的代時分別為90、120、70 min,長雙歧桿菌為100、90、145 min[16],實驗證明,假小鏈雙歧桿菌在葡萄糖培養基中的代時與長雙歧桿菌相近,而在GOS和FOS培養基中的代時要高于上述2種雙歧桿菌。

生長和繁殖是保證微生物獲得生物量的必要前提,生長意味著原生質含量的增加,而生長量的測定可以以此為依據,通過比濁法進行間接測定。從圖3-a～圖3-i,12株假小鏈雙歧桿菌在每種碳源培養基中的OD600值中位數分別為0.99、1.00、0.85、0.75、1.01、0.31、0.82、0.70、0.85。結果顯示,每株雙歧桿菌在不同碳源培養基中表現出生長量的差異性,FFJND17M1在葡萄糖、GOS、蔗糖培養基中的OD600值最高(圖3-a、圖3-b、圖3-i,P<0.05),FGZ6I1M3在菊粉、木糖培養基中的OD600值最高(圖3-d、圖3-f,P<0.05),FXJWS49M35在葡萄糖、FOS、菊粉培養基中的OD600值較低(圖3-a、圖3-c、圖3-d,P<0.05)。

a-葡萄糖培養基;b-GOS培養基;c-FOS培養基;d-菊粉培養基;e-乳糖培養基;f-木糖培養基;g-麥芽糖培養基;h-D-半乳糖培養基;i-蔗糖培養基圖3 假小鏈雙歧桿菌在不同碳源培養基中的OD600值Fig.3 OD600 of B.pseudocatenulatum in different carbon source medium注:每株菌N=3,不同字母(a～l)表示不同組之間存在顯著差異(P<0.05)

有研究[16]檢測了5株假小鏈雙歧桿菌在木糖培養基中的OD600值為0.6～0.9,高于本實驗結果,其他雙歧桿菌(兩歧雙歧、短雙歧、長雙歧桿菌嬰兒亞種)在乳糖培養基中的OD600值在0.1～0.2。5株假小鏈雙歧桿菌在乳糖培養基中的OD600值在0.7～1.1,與本研究一致,其他雙歧桿菌(兩歧雙歧、短雙歧、長雙歧桿菌嬰兒亞種,青春雙歧桿菌)在乳糖培養基中的OD600值在0.6～0.8,總而言之,其他研究的實驗也顯示出不同假小鏈雙歧桿菌對碳水化合物利用能力具有差異性,其在乳糖培養基中的生長能力較強。

將12株菌在每種碳源培養基中的代時處于整體代時中位數以下,或OD600值在整體OD600值中位數以上的指標記為達標,將達標數目進行統計,各株菌表現情況如表3所示?？芍?2株假小鏈雙歧桿菌在碳源培養基中的生長情況也呈現出了較大的差異性,在這些實驗菌株中,FGSYC12M4、FGZ16I1M1、FFJND17M1的表現最好,FXJWS49M35、FXJWS49M33、FAHBZ2M3的表現最差。有趣的是,有些菌株在代時(生長速率)和OD600值(生長量)中呈現出了相反的趨勢,如FHNBA14M1在木糖、FOS、GOS培養基中代時較長,但24 h后的OD600值卻較高,A14在乳糖、菊粉、D-半乳糖、D-麥芽糖、木糖、低聚果糖培養基中的代時很短,但24 h后的OD600值卻較低,這表明生長速率較快的菌株最終的生長量并不一定較高。有研究顯示出類似的結果,如假小鏈雙歧桿菌在0.5% 的FOS、GOS培養基中的代時分別為160 min和110 min,但最終的OD600值分別為1.2和1.0[16]。

表3 假小鏈雙歧桿菌在9種碳源培養基中的達標情況Table 3 The up-to-standard status of B.pseudocatenulatum in 9 kinds of carbon source media

2.3 假小鏈雙歧桿菌糖苷水解酶分布特征

如圖4所示,假小鏈雙歧桿菌的糖苷水解酶分布同樣具有差異性。在假小鏈雙歧桿菌含量較多的前30個糖苷水解酶中,80%以上與植物碳源相關,乳源相關的為GH42和GH2。在碳水化合物利用中表型優良的菌株FGSYC12M4、FGZ16I1M1、FFJND17M1均含有3個以上特異性糖苷水解酶,如GH5_44、GH13_13、GH1、GH36等,GH5為β-1,3-葡萄糖苷酶,GH13為蔗糖磷酸化酶/α-1,6-葡萄糖苷酶,GH1為β-葡萄糖苷酶,GH36為α-半乳糖苷酶[16],這些均為植物碳源相關的糖苷水解酶,此外,ZHU等[23]報告過植物乳桿菌QS7T在以菊粉為碳源的培養基中的最大OD600值為1.891±0.028,并且通過基因組測序和分析顯示,與菊粉消耗相關的功能基因(特別是糖苷水解酶)表達顯著上調。在本研究中,FFJND17M1基因組中編碼GH5_44和GH13_13的基因數量分別是其他11株假小鏈雙歧桿菌的2倍或1.5倍,這也許與FFJND17M1在葡萄糖、蔗糖培養基中的生長量顯著高于其他菌株的結果有關。FXJWS49M35、FXJWS49M33、FAHBZ2M3的表型最差,基因分析也發現它們的糖苷水解酶含量低于其他菌株。研究發現假小鏈雙歧桿菌利用乳糖的能力較強,可能與它們含有較多的乳源糖苷水解酶(GH42、GH2)有關。

圖4 假小鏈雙歧桿菌糖苷水解酶分布特征Fig.4 Distribution of glycoside hydrolase across B.pseudocatenulatum

雙歧桿菌因編碼大量與碳水化合物修飾相關的酶而表現出對富含復雜碳水化合物的胃腸道環境的適應性[24]。不同的假小鏈雙歧桿菌利用碳水化合物的能力具有差異,很可能是因為降解和轉運碳水化合物的酶不同,研究表明,假小鏈雙歧桿菌能較好的降解復雜的植物多糖[14],在本實驗中,假小鏈雙歧桿菌也表現出較強的降解植物碳源的能力。據報道,假小鏈雙歧桿菌代表菌株C15的β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖滲透酶等糖利用基因拷貝數顯著高于其他菌株[15]。菌株IPLA因包含4個GH3家族的編碼基因而被預測有利用大豆異黃酮苷的性狀[14]。目前關于假小鏈雙歧桿菌碳水化合物利用相關基因的研究還缺少針對該菌種的全面研究。

2.4 實驗菌株占據腸道豐度的潛力研究

確定單一菌株對單一碳源的利用能力有利于分析菌株的生理特性,但腸道中復雜的碳水碳水化合物環境需要設計更復雜的實驗來評估其對胃腸道環境的適應性及在腸道環境中占據豐度優勢的潛力。選取在碳水化合物利用實驗中表現差異較大的4株雙歧桿菌(FHNBA14M1、FAHBZ2M3、A14、FGSYC12M4)進行人糞便體外發酵實驗,將菌株接入GMM培養基發酵24 h后對其中的假小鏈雙歧桿菌進行絕對定量,實驗結果顯示FGSYC12M4增殖量為5.57×107CFU/mL,顯著高于FAHBZ2M3和FHNBA14M1(圖5),4株菌的增殖量大小與碳水化合物利用能力的強弱趨勢一致(表3),即FGSYC12M4的碳水化合物利用能力最強,在體外發酵實驗中的增殖量也最高,FAHBZ2M3的碳水化合物利用能力最弱,在體外發酵實驗中的增殖量也最低。但是,FHNBA14M1和A14兩株菌在表3中雖然總計差異不大,但兩者卻處于代時或OD600值兩個極端中,而體外發酵實驗結果顯示,偏向于代時較短或者OD600值較高的菌株在增殖量方面并不體現差異性。即假小鏈雙歧桿菌占據腸道豐度的潛力是基于其對于碳水化合物利用能力的綜合考量。

圖5 假小鏈雙歧桿菌在GMM培養基中發酵24 h后的增殖Fig.5 Proliferation of B.pseudocatenulatum after 24 h of fermentation in GMM medium注:每組N=3,字母“a～c”表示顯著性差異(P<0.05)

吳歡等[6]從兒童營養干預后的腸道中分離出優勢菌假小鏈雙歧桿菌C95,進行了復雜碳水化合物利用實驗(包括FOS、中長鏈菊粉、低聚麥芽糖、抗性淀粉等),發現其對碳水化合物的利用能力很強,認為這在一定程度上可以解釋雙歧桿菌被復雜碳水化合物富集而在腸道中成為優勢菌的現象。SONNENBURG等[25]也表明,碳水化合物飲食的高低會影響腸道菌群的豐度。因此,碳水化合物利用能力強的菌株具有占據高豐度的潛力。

3 結論

為研究不同假小鏈雙歧桿菌對碳水化合物利用能力的差異性,本研究對12株假小鏈雙歧桿菌在17種碳水化合物中的生長特性進行了測定,使用溴甲酚紫檢測菌株對不同碳水化合物的利用情況,發現12株菌對碳水化合物利用的種類為5～11種。12株假小鏈雙歧桿菌編碼的大多為降解植源性碳水化合物的糖苷水解酶,在碳水化合物利用中展現出的株間差異可能是因為降解和轉運碳水化合物的酶具有差異性。通過測定生長曲線,計算代時,檢測OD600值確定了不同菌株在9種碳水化合物中的生長能力,以中位數劃分每株菌的達標數量,發現12株菌的達標數目為5～16個不等。通過人糞便體外發酵實驗驗證了達標數量與其占據豐度的大小有正相關性。結果顯示不同的假小鏈雙歧桿菌對碳水化合物利用具有較大的差異,本研究為假小鏈雙歧桿菌的碳水化合物利用能力的研究提供了實驗數據,為假小鏈雙歧桿菌作為益生元、益生菌的開發提供了參考。