群體感應動態調控促進大腸桿菌合成紅景天苷

沈玉平,賀茜,周紫微,何春蘭,張祖姣,3*

1(湖南科技學院 化學與生物工程學院,湖南 永州, 425199) 2(湖南南嶺地區植物資源研究開發湖南省工程研究中心,湖南 永州,425199) 3(湖南省銀杏工程技術研究中心,湖南 永州, 425199)

紅景天苷是傳統中藥紅景天(RhodiolaroseaL.)的主要藥理成分,具有增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、美白和抗衰老等多重生理功效,廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等領域,是一種極具應用與開發價值的高品質天然產物[1]。植物提取是目前紅景天苷生產的主要方法,但紅景天資源日益稀缺,并且存在生長周期長、含量低、提取工藝復雜等固有缺陷。雖然研究者后來開發了人工種植、組織培養和細胞懸浮培養等技術,在一定程度上緩解了對紅景天資源的依賴,但仍未解決生長周期長和產量低的問題[2-3]。隨著紅景天苷藥理機制和生理功效研究不斷深入,市場需求與日俱增,紅景天苷的生產面臨極大挑戰。

基于合成生物學技術構建工程菌發酵生產天然產物,是替代傳統植物提取法,實現天然產物綠色、可持續生產的重要方法。目前,已有研究者通過改造模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母,實現了紅景天苷從頭合成(圖1)[4-5]。CHUNG等[4]和BAI等[5]通過優選合成途徑關鍵酶[如醇脫氫酶和尿苷二磷酸(uridine diphosphate, UDP)-葡萄糖糖基轉移酶]、阻斷競爭途徑(如pheA、feaB)、解除反饋抑制(如敲除tyrR)等策略改造大腸桿菌,可產紅景天苷288、56.9 mg/L?；谙嗨频牟呗?JIANG等[6]改造釀酒酵母,搖瓶發酵,紅景天苷產量達到0.73 g/L。GUO等[7]在釀酒酵母中重構中心代謝途徑,5 L發酵罐分批補料發酵可產紅景天苷1.82 g/L。LIU等[8]通過模塊工程改造釀酒酵母,5 L發酵罐分批補料發酵,紅景天苷產量達到26.55 g/L,這是目前微生物合成紅景天苷的最高水平。LIU等[9]將兩株改造的營養缺陷型大腸桿菌進行共培養,5 L發酵罐分批補料發酵可產紅景天苷6.03 g/L。LIU等[10]在酪醇高產菌的基礎上,通過增加外源基因UGT85A1拷貝數,5 L發酵罐分批補料發酵可產紅景天苷9.48 g/L,這是目前大腸桿菌合成紅景天苷的最高水平。

雖然目前紅景天苷合成水平得到大幅度提升,但與同一代謝途徑中酪氨酸(55 g/L)[11]的產量仍差距較大。同時,作者在分析文獻時發現,紅景天苷發酵菌體密度普遍偏低,并伴隨高濃度中間產物酪醇殘留,如GUO等[7]利用釀酒酵母發酵紅景天苷,5 L發酵罐分批補料發酵,菌體密度僅為23.24 g DCW/L,紅景天苷1.82 g/L,而酪醇卻高達8.48 g/L;LIU等[9]和LIU等[10]利用大腸桿菌發酵紅景天苷,5 L發酵罐分批補料發酵OD600值均不超過40,LIU等[10]還發現紅景天苷工程菌OD600值較野生型大幅度下降。并且,CASADEY等[12]和本研究均發現酪醇具有良好的抑菌功能,GONZLEZ等[13]亦證實酪醇抑制細菌和酵母生長,影響細胞形態和生理狀態。此外,由于大腸桿菌缺乏對外源途徑的精確調控,因而無法充分發揮外源途徑的生物學功能,導致產物合成受阻。因此,酪醇對菌體的生長抑制和外源途徑缺乏調控是限制紅景天苷產量進一步提升的瓶頸。群體感應(quorum-sensing, QS)是一種自誘導系統,可根據細胞密度自動調控基因的表達,可較好地平衡細胞生長和產物合成,目前已成功提升大腸桿菌4-羥基苯乙酸[14]、肌醇和葡糖二酸[15]產量。因此,本研究以L值-多巴高產菌大腸桿菌(Escherichiacoli)DOPA 30N[16]為底盤細胞,通過篩選合成途徑關鍵酶、優化底盤細胞和群體感應動態調控等策略,緩解中間產物酪醇的毒性作用,平衡產物合成與細胞生長,進而提高紅景天苷合成水平。研究結果將有利于改變目前紅景天苷生產困境,并為其他糖苷類天然產物的微生物合成提供示范和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質粒和引物

本研究所用質粒和菌株請見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035417,下同),引物請見附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035417,下同)。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):胰蛋白胨,10;酵母提取物,5;NaCl,10;pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

SOC培養基(g/L):胰蛋白胨20,酵母提取物5,葡萄糖3.6,KCl 0.186,NaCl 0.5,MgCl20.95,116 ℃滅菌20 min,用于電轉化后復蘇。

LBGT培養基[16](g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,葡萄糖25,微量元素10 mL,pH 7.0～7.2,116 ℃滅菌20 min。微量元素(g/L):FeSO4·7H2O 10,ZnSO4·7H2O 2.2,MnSO4·4H2O 0.58,CuSO4·5H2O 1.0,Na2B4O7·10H2O 0.2,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1,35% HCl,10 mL,過濾除菌,接種前加入培養基。

補料培養基(g/L):葡萄糖500,MgSO4·7H2O 30,116 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

限制性內切酶,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Prime Star Max DNA聚合酶,寶日醫生物技術(北京)有限公司;質粒提取和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,美基生物科技(廣州)有限公司;Gibson Assembly試劑盒,NEB(北京)有限公司;葡萄糖測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;抗生素,生工生物工程(上海)股份有限公司。L-酪氨酸、L-多巴、酪醇、4-羥基苯乙酸、紅景天苷和脫水四環素,百靈威科技(北京)有限公司;色譜級甲醇、三氟乙酸,安譜實驗科技股份(上海)有限公司,其余均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見分光光度計、LC20-AT高效液相色譜,日本島津公司; 2 L×4 Minibox5 Intelli-Ferm平行生物反應器,迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組質粒的構建

采用酶切連接法和Gibson組裝法構建質粒。重組質粒經菌落PCR、酶切圖譜及測序正確后可使用。

酪醇合成途徑質粒的構建:分別PCR擴增大腸桿菌(yqhD、yiaY、frmA、yjgB、yahk、adhP、aldB、adhE)和釀酒酵母的醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)基因(ADH6),插入到pBbB2K-GFP的EcoRⅠ/BamHⅠ間,獲得醇脫氫酶系列表達載體。隨后PCR擴增ARO10F138L/D218G并去掉終止密碼子TAA,采用BglBrick組裝技術[17],插入到醇脫氫酶表達載體的EcoRI/BglⅡ間,使二者通過linker(GSG)2融合表達。

紅景天苷合成途徑質粒構建:通過Gibson組裝法構建。庫葉紅景天(Rhodiolasachalinensis)來源UGT73B6(GeneBanK號:AY547304)和UGT72B14(GeneBanK號:EU567325),擬蘭芥(Arabidopsisthaliana)來源UGT85A1(GeneBanK號:At1 g22400),以及地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)來源UGT1(GeneBanK號:AAU40842)均經密碼子優化后由金唯智(蘇州)生物科技有限公司進行全基因合成。設計引物去掉yahK終止密碼子,PCR擴增pBbB2K-ARO10F138L/D218G-L-yahK整個質粒以及UGT73B6、UGT72B14、UGT85A1和UGT1,瓊脂糖凝膠純化PCR產物后,按照Gibson Assembly試劑盒說明書操作,構建ARO10F138L/D218G-L-yahK分別與UGT73B6、UGT72B14、UGT85A1、UGT1融合表達的紅景天苷合成途徑質粒。

sgRNA表達質粒構建:采用反向PCR構建feaB敲除及pgm、galU啟動子置換所需sgRNA表達質粒。

群體感應調控紅景天苷合成途徑質粒構建:以pBbB2k-ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1和pZBK-PesaSIC-PesaRAS為模板,分別PCR擴增ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1和群體感應質粒骨架,純化PCR產物,按照Gibson Assembly試劑盒說明書,構建群體感應調控紅景天苷合成途徑質粒pZBK-PesaRAS-SL。

1.3.2 基因編輯

feaB基因敲除和P37置換pgm、galU天然啟動子,均參照JIANG等[18]報道的方法,采用CRISPR/Cas9技術,通過同源重組的方法進行。

1.3.3 工程菌發酵

種子培養:挑取活化的單菌落接種至含20 mL LB培養基的100 mL搖瓶中,37 ℃、200 r/min培養10 h。

搖瓶發酵:測定種子液OD600值,按照初始OD600=0.1的接種量接種至裝有50 mL LBGT培養基的250 mL 搖瓶中,30 ℃、200 r/min培養48 h,發酵結束后測定生物量(OD600值)、酪醇和紅景天苷濃度。

發酵罐發酵:采用分批補料發酵的方式,在2 L×4平行發酵罐上執行,裝液量1.2 L,以初始OD600值 0.2 左右的接種量接種,通氣量1.8 L/min,發酵溫度30 ℃,以氨水調節pH值恒定在7.0(死區0.1),攪拌轉速400～1 200 r/min,溶氧設定為25%(死區5%)并與轉速關聯控制,初始葡萄糖質量濃度設置為5 g/L,采用pH-stat補料策略,每隔4 h取樣測定OD600值、葡萄糖濃度、酪醇和紅景天苷產量。

含有質粒的工程菌,按照要求加入相應濃度的抗生素。需要誘導表達的菌株,OD600值達到2.5時加入脫水四環素(工作質量濃度120 ng/mL)誘導。

1.3.4 酪醇和紅景天苷檢測

參照作者[14]前期分析4-羥基苯乙酸的方法,利用HPLC檢測紅景天苷和酪醇。取發酵液2 mL,10 000 r/min離心1 min,上清液0.22 μm濾膜過濾,收集濾液檢測。分析條件:LC20-AT HPLC檢測系統,Inertsil ODS-SP C18反相柱(GL Inertsil ODS-SP 150 mm×4.6 mm,5 μm),SPD-M20A二極管陣列檢測器,流動相A為0.2%三氟乙酸,流動相B為100%甲醇,柱溫30 ℃,進樣體積10 μL,檢測波長222 nm,采用梯度洗脫法檢測。分析程序:0～20 min甲醇質量分數由14%梯度上升至45%,隨后下降至14%直至30 min結束,流速0.5 mL/min。在此條件下,紅景天苷、酪醇、L-酪氨酸、L-多巴和4-羥基苯乙酸可很好地分離開來(圖2-a),發酵液中酪醇(圖2-b)和紅景天苷(圖2-c)保留時間與標準品一致。

a- 標準品液相色譜圖;b- 酪醇工程菌TR5發酵液液相色譜圖;c- 紅景天苷工程菌SL3發酵液液相色譜圖圖2 HPLC分析紅景天苷、酪醇標準品和工程菌發酵液的色譜圖Fig.2 HPLC analysis of standard tyrosol, standard salidroside and fermentation broth of engineered E.coli

1.3.5 酪醇對底盤細胞生長的影響

挑取活化的SLP單菌落,接種至含20 mL LB培養基的100 mL搖瓶中,37 ℃、200 r/min培養10 h,以初始OD600=0.1的接種量,分別接種至酪醇質量濃度0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 g/L的5 mL LB試管中,培養12 h后測量OD600值,考察不同濃度酪醇對底盤細胞SLP生長的影響。

1.3.6 數據統計和分析

所有實驗均設置3次重復,數據以“平均值±標準差”的形式呈現,采用SPSS 26.0進行方差分析和t檢驗,P<0.05定義為具有顯著性,P<0.01定義為極顯著。

2 結果與分析

2.1 紅景天苷合成途徑篩選

2.1.1 酪醇合成途徑篩選

酪醇與UDP-葡萄糖是合成紅景天苷的直接前體物,4-羥基苯乙醛則是合成酪醇的直接前體物?；诓煌?-羥基苯乙醛合成方式,大腸桿菌中構建的人工酪醇合成途徑有3條,即苯丙酮酸脫羧酶(如ARO10和IpdC)-醇脫氫酶途徑[19-21]、芳香醛合成酶(如AAS)-醇脫氫酶途徑[4, 22]和酪氨酸脫羧酶(如TydC、AspC和HisC)-酪胺氧化酶(如TynA和TYO)-醇脫氫酶[23]途徑。作者[14]前期對比了3條4-羥基苯乙醛合成途徑,發現釀酒酵母來源的苯丙酮酸脫羧酶ARO10效率最高,并通過定向進化獲得了催化效率大幅度提高的突變體ARO10F138L/D218G。以此為基礎,將其與不同來源的醇脫氫酶融合表達,導入L-多巴高產菌DP中,以僅表達ARO10F138L/D218G的質粒為對照,發酵考察其對酪醇合成的影響,結果見圖3。

圖3 過表達醇脫氫酶基因對酪醇合成的影響Fig.3 Effects of overexpression of alcohol dehydrogenase genes on the tyrosol production

由圖3可知,僅表達ARO10F138L/D218G亦可合成酪醇,說明內源醇脫氫酶可催化4-羥基苯乙醛生成酪醇,LIU等[9]、YANG等[24]和薛宇翔等[25]在酪醇合成研究中也證實了這一結論。過量表達醇脫氫酶,除frmA和adhP之外,可提高酪醇產量12.70%～57.98%,yahK效果最佳,達到(1 086.1±52.3) mg/L。但是,LIU等[9]研究結果顯示,大腸桿菌內源醇脫氫酶足以飽和底物,過表達反而導致酪醇產量降低。酪醇與L-多巴均為酪氨酸衍生物,本研究出發菌株DP為L-多巴高產菌,對糖酵解、磷酸戊糖和莽草酸途徑進行過多處遺傳修飾和改造,并且進化后的突變體ARO10F138L/D218G催化效率大幅度提升,因而提高了代謝通量,使得內源醇脫氫酶不能充分飽和底物。LI等[20]和曾嬌嬌等[22]在大腸桿菌酪醇合成研究中發現,部分醇脫氫酶基因過表達后會導致酪醇產量降低,本研究中過表達frmA和adhP亦導致酪醇產量下降,其原因尚需設計實驗進一步研究。

2.1.2 紅景天苷合成途徑篩選

尿苷二磷酸葡萄糖糖基轉移酶(uridine diphosphate glucosyltransferase, UGT)是紅景天苷合成的關鍵酶。研究顯示,庫葉紅景天來源的UGT73B6[26]和UGT72B14[27],擬蘭芥來源的UGT85A1[4,9-10]和地衣芽孢桿菌來源的UGT1[28]均可催化酪醇形成紅景天苷,因此我們將上述4個UGT與最優酪醇合成途徑ARO10F138L/D218G-L-yahK融合表達,考察其對紅景天苷合成的影響,結果見圖4。

圖4 過表達UGT基因對紅景天苷合成的影響Fig.4 Effects of overexpression of UGT genes on the salidroside production

由圖4可知,4個UGT均可催化酪醇生成紅景天苷,UGT85A1催化效率最高,可產紅景天苷(605.8±16.8) mg/L。YU等[27]通過大腸桿菌異源表達UGT72B14和UGT73B6,并進行了純化和表征,結果顯示UGT72B14催化效率較UGT73B6高出170%。FAN等[28]體外催化實驗結果顯示,UGT1催化效率優于UGT73B6。LIU等[9]研究發現,在大腸桿菌中UGT85A1紅景天苷產量遠高于UGT1。CHUNG等[4]比較了12個擬蘭芥來源的UGT,發現UGT85A1紅景天苷合成效率最高。本研究系統比較了4個UGT在大腸桿菌中的紅景天苷合成效率,發現UGT85A1最高,因此后續實驗采用UGT85A1。

2.2 優化底盤細胞提高紅景天苷產量

UDP-葡萄糖和酪醇是合成紅景天苷的直接前體物,二者充足和均衡的供給是紅景天苷高效合成的關鍵。由圖1分析可知,敲除feaB可阻斷4-羥基苯乙酸合成途徑,使代謝流轉向酪醇的合成;強化表達pgm和galU有利于提高UDP-葡萄糖的供給。為此,敲除DP的feaB基因,以P37啟動子置換pgm和galU天然啟動子PseqA和PgalU,同時以高翻譯效率UTR序列“TTTCGGAATTAAGGAGGTAATAAAT”置換其天然5′-UTR,以強化表達pgm和galU,獲得菌株SLP。將最優紅景天苷合成途徑質粒pBbB2K-ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1引入至SLP,獲得菌株SLP3,發酵考察其對紅景天苷合成的影響,結果見圖5。

圖5 優化底盤細胞對紅景天苷合成的影響Fig.5 Effect of engineering of chassis cell on the production of salidroside注:*表示顯著(P<0.05);**表示極顯著(P<0.05)(下同)

由圖5可知,底盤細胞優化后,紅景天苷產量和酪醇產量均極顯著提高(P<0.01),達到(1 156.3±44.2) mg/L,較對照SL3提高95.03%,說明敲除feaB,強化表達pgm、galU提高前體物供給的策略可有效地提高紅景天苷產量。敲除feaB,可阻斷4-羥基苯乙酸競爭途徑,促進前體物酪醇的合成,這在CHUNG等[4]、薛宇翔等[25]和YANG等[29]的研究也證實了這一結論。同時,發酵液中酪醇比例亦極顯著下降(P<0.01),由53.19%降低至42.19%,說明強化表達pgm、galU增大了UDP-葡萄糖的供給,將酪醇轉化為紅景天苷。但在SLP3發酵液中,仍有(842.4±22.7) mg/L酪醇殘留,且OD600值亦低于正常水平,可能是酪醇對底盤細胞的毒性作用,代謝產物的積累以及質粒高表達造成的代謝負擔,導致菌體生長受到抑制,進而影響紅景天苷的合成。

2.3 群體感應動態調控對紅景天苷合成的影響

2.3.1 酪醇對底盤細胞生長的影響

CASADEY等[12]發現酪醇具有良好的抑菌功能,GONZLEZ等[13]發現酪醇可影響細菌和酵母的細胞形態和生理狀態。此外,在大腸桿菌和釀酒酵母紅景天苷合成研究中,均發現菌體發酵密度低于正常水平[6-7,9-10]。為此,考察了酪醇對底盤細胞SLP的影響,結果見圖6。

圖6 酪醇對底盤細胞生長的影響Fig.6 Effect of tyrosol on the growth of chassis cell

由圖6可知,酪醇強烈抑制底盤細胞SLP生長,2 g/L 抑制率達33.5%,而8 g/L則幾乎完全抑制菌體生長。此外,全細胞生物催化的酪醇產量和底物轉化率均遠高于從頭合成[28-29],這也間接證實了酪醇對細胞的毒性作用。因此,減少中間產物酪醇積累,解除其毒性作用,是進一步提升紅景天苷產量的關鍵。

2.3.2 群體感應動態調控對紅景天苷合成的影響

群體感應是一種細胞與細胞間的通訊系統,可依據細胞密度自動調控基因表達。作者前期構建了一個兼具激活和抑制功能的群體感應質粒pZBK-PesaSIC-PesaRAS(圖7-a),可以同時調控競爭途徑和合成途徑[14]。以群體感應激活啟動子PesaR控制紅景天苷合成途徑ARO10F138L/D218G-L-yahK-L-UGT85A1,可動態激活合成途徑的表達。早期細胞密度低時,合成途徑的表達受到限制,促進細胞生長,隨著細胞密度的增大,逐步增強合成途徑的表達,以此實現群體感應動態調控,從而減輕中間產物酪醇對細胞的毒性作用,緩解紅景天苷積累和質粒高表達造成的代謝負擔,平衡細胞生長與產物合成。將紅景天苷群體感應調控質粒pZBK-PesaRAS-SL(圖7-b)引入底盤細胞SLP,獲得工程菌SLPQ3,發酵考察其對紅景天苷合成的影響。圖7-c發酵結果顯示,SLPQ3的紅景天苷產量和OD600值較對照SLP3極顯著提高(P<0.01),紅景天苷產量達到(1 484.6±21.4) mg/L,OD600值達到8.18±0.23,較靜態誘導表達工程菌SLP3分別提高36.3%和31.6%。此外,發酵液酪醇比例亦極顯著下降(P<0.01),由44.4%下降至30.3%,說明群體感應動態在一定程度上可降低酪醇積累,減輕毒性作用,緩解生長抑制,進而提高紅景天苷產量。作者在前期研究中,通過群體感應系統動態調控4-羥基苯乙酸合成途徑,使其產量提高了46.4%[14]。這證實群體感應系統作為一種自誘導系統,可以減輕產物或中間產物對底盤細胞的毒性作用,較好的平衡生長和產物合成,這對高毒性化學品和其他糖苷類天然產物的生物合成具有廣泛的借鑒和應用價值。

a-群體感應調控質粒;b-群體感應調控紅景天苷合成途徑質粒;c-群體感應調控紅景天苷合成途徑發酵結果圖7 群體感應動態調控對紅景天苷合成的影響Fig.7 Effect of dynamic quorum-sensing control of salidroside synthesis pathway on the production of salidroside注:pZBK-PesaSIC-PesaRAS工作機制。在沒有esaI合成的群體感應信號分子AHL存在時,esaRI70V編碼的轉錄因子EsaRI70V可以與啟動子PesaS結合而激活下游基因(MCS1位點)的轉錄,同樣EsaRI70V可以與啟動子PesaR結合抑制下游基因(MCS2位點)的表達。隨著細胞生長,開始積累信號分子AHL,AHL與轉錄因子EsaRI70V結合,導致EsaRI70V與啟動子PesaS解離,抑制其下游基因(MCS1位點)的表達,同時使EsaRI70V與啟動子PesaR解離,激活其下游基因(MCS2位點)的表達。由于群體感應信號分子AHL數量與細胞密度相關,因此群體感應裝置的激活和抑制均隨細胞密度呈動態變化,細胞密度大,其激活和抑制越強

2.4 2 L發酵罐發酵生產紅景天苷

在群體感應激活系統中,基因表達強度隨細胞密度的增大而增加,為進一步驗證群體感應調控工程菌SLPQ3的紅景天苷生產潛力,在2 L平行生物反應器系統中同時對SLP3和SLPQ3進行發酵。圖8發酵結果顯示,群體感應動態調控工程菌SLPQ3最大OD600值達到46.74,較對照SLP3提高26.6%(P<0.01);紅景天苷產量達到4.38 g/L,較SLP3提高48.2%(P<0.01);此外,發酵液中酪醇比例由33.67%降至17.86%(P<0.01),展現了良好的生產潛力。

圖8 群體感應調控菌株SLPQ3分批補料發酵結果Fig.8 Fed-batch fermentation of strain SLPQ3 with dynamic quorum-sensing control of salidroside synthesis pathway

3 討論

紅景天苷是一種高品質天然產物,極具應用與開發價值。本研究在前期研究獲得的苯丙酮酸脫羧酶突變體ARO10F138L/D218G基礎上,通過篩選醇脫氫酶和UDP-葡萄糖糖基轉移酶,紅景天苷產量達到(605.8±16.8) mg/L;通過敲除競爭途徑基因feaB,強化表達UDP-葡萄糖合成的關鍵基因pgm和galU,紅景天苷產量提高95.03%,達到(1 156.3±44.2) mg/L。采用群體感應激活系統動態調控紅景天苷合成途徑,有效地減輕了酪醇的毒性作用,緩解了生長抑制,搖瓶發酵OD600值達到8.18±0.23,紅景天苷產量達(1 484.6±21.4) mg/L,較對照SL3分別提升36.3%和32.6%。2 L發酵罐水平發酵,紅景天苷產量達到4.38 g/L,OD600值達到46.74,分別較靜態誘導表達提高48.2%和26.6%,展現了良好的生產能力。

本研究通過不同的策略逐步提高了紅景天苷產量,但仍有較高濃度中間產物酪醇殘留,且菌體發酵密度也未達到正常水平,這說明群體感應動態調控雖可減輕酪醇毒性作用,緩解生長抑制,但并不能達到完全消除的目的。適應性進化可在不需要任何遺傳調控信息的條件下,快速提高細胞的耐受性[30],因此后續可通過適應性進化提高底盤細胞的酪醇耐受性。此外,還可對外源酶UGT85A1定向進化提高酶活力,將積累的酪醇轉化為紅景天苷,也可通過可調控基因間隔區(TIGR)、SpyCatcher-SpyTag等底物通道平衡基因表達,減少中間產物酪醇積累。紅景天苷合成需要大量NADPH和ATP,目前已有大量輔因子改造提高產物合成效率的案例[31-32],因此可考慮重構NADPH合成途徑或CRISPRi抑制NADPH和ATP消耗相關基因,提高NADPH和ATP供給,促進紅景天苷合成。在本研究中,紅景天苷搖瓶發酵水平為(1 484.6±21.4) mg/L,與LIU等[9]大腸桿菌(1 072.46 mg/L)以及LIU等[8]釀酒酵母(1 575.45 mg/L)的搖瓶發酵水平相近,但本研究發酵罐發酵水平僅為4.38 g/L,與他們(6.03 g/L)[9]和(26.55 g/L)[8]的發酵罐發酵水平存在較大差距,因此后續可通過改變發酵策略和優化發酵條件進一步釋放菌株生產潛力。