桑葉中主要酚類物質與蛋白的相互作用及復合物性能分析

孟雨薇,陳偉波,周軍,2,李湘洲,2*

1(中南林業科技大學 材料科學與工程學院,湖南 長沙,410004) 2(南方林業生態應用技術國家工程實驗室,湖南 長沙,410004)

桑(MorusalbaL.)為?？粕俚穆淙~喬木或灌木,在世界各地分布廣泛。桑葉作為藥食同源植物,含有多種活性物質,如蛋白質、多糖、生物堿、多酚、維生素、礦物質等[1],具有降低膽固醇[2]、防治糖尿病[3]、預防肥胖[4]、抗氧化[5]等功能。已有研究表明,桑葉中蛋白質含量占其干基重的15%～30%,且不含膽固醇。由于桑葉蛋白質含量和體內消化率高,其被認為是工業消費的潛在植物蛋白質來源[6]。但目前,桑葉主要用于桑蠶業的飼料以及提取生物堿等,僅少量加工為桑葉茶等飲料及功能產品,在食品等領域還未得到充分開發與應用。

酚類化合物具有至少一個芳香環和一個或多個羥基,是一種天然抗氧化劑,此外酚類化合物還具有抑菌、抗過敏、抗衰老、抗腫瘤和抗糖尿病等功能,受到廣泛的關注[7]。酚類物質作為桑葉的主要活性成分之一,主要包括綠原酸、蘆丁、白藜蘆醇等11種單體[8]。研究表明,酚類與蛋白、多糖和油脂等生物大分子之間可以通過氫鍵、疏水相互作用、范德華力和靜電相互作用發生可逆的非共價相互作用或通過蛋白質中的親和殘基與醌形成共價鍵發生不可逆的共價相互作用[9],從而改變蛋白質的消化功能,并對食品體系產生明顯的影響。ZHAO等[10]研究發現單寧酸和沒食子酸會降低魚皮膠原蛋白和酪蛋白的水解程度并影響其抗氧化性能。雷選[11]的研究表明,桑葚多酚可以抑制酪蛋白在小腸階段的水解。ZHOU等[12]研究發現大豆分離蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯相互作用形成的共價復合物抗消化能力較強,在腸道中更加穩定。

蛋白質和酚類化合物在包括桑葉等多種食物或食物混合物中天然存在,這些化合物之間的相互作用在食品加工、運輸、貯藏及食用后對機體的影響至關重要[13]。然而目前大部分研究主要集中于外源酚類物質對蛋白性質的影響,而對植物內源酚類與蛋白的相互作用研究較少。綠原酸(chlorogenic acid, Cla)和白藜蘆醇(resveratrol, Res)作為桑葉內源酚類物質,在加工和食用等過程中可能與桑葉蛋白(mulberry leaf protein, MLP)發生相互作用,從而影響桑葉蛋白的結構與功能特性,但此方面的研究報道較少。因此,本文選取桑葉內源酚類物質綠原酸和白藜蘆醇,利用紫外-可見光光譜、熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜分別研究其與桑葉蛋白的相互作用及對蛋白體外消化和抗氧化等功能性質的影響,以期揭示食物內源性酚類化合物與蛋白之間的影響規律,為桑葉功能性產品的開發與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉蛋白,西安國豪生物科技有限公司;98%白藜蘆醇、98%綠原酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶,上海源葉生物科技有限公司;DPPH(純度>97.0%),梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;ABTS(純度>98.0%),上海藍季科技發展有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHA-B水浴恒溫振蕩器,上海汗諾儀器有限公司;Alpha傅里葉紅外變換光譜儀,美國布魯克公司;TU-1801紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;F-7000型熒光分光光度計,日本日立公司;電子分析天平,蘇州島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 桑葉酚類/蛋白溶液的制備

稱取一定質量的桑葉蛋白粉,溶解至0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)中,取上清液,4 ℃貯藏備用。另稱取一定質量的Res和Cla,分別溶解至10 mol/L 和0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)中,配制成0.1 mmol/L的Res儲備液和2 mmol/L的Cla儲備液。

桑葉酚類/蛋白復合溶液:取4 mL MLP溶液于10 mL容量瓶中,分別加入不同體積的酚類化合物溶液,使終濃度分別為0、4、8、12、16、20 μmol/L,混勻,于37 ℃振蕩12 h。

1.3.2 紫外-可見光光譜分析

采用紫外-可見分光光度法測定MLP、酚類/蛋白復合溶液的紫外-可見吸收光譜。將樣品置于光程為1 cm 的比色皿中進行掃描,掃描范圍為190～500 nm。

1.3.3 熒光光譜分析

利用F-7000熒光分光光度計測定不同溫度下(300、305、310 K)MLP和酚類/蛋白復合溶液的熒光光譜,以不含酚類物質的MLP做空白對照。激發波長280 nm,激發和發射狹縫寬度5 nm,發射波長掃描范圍300～400 nm。

采用Stern-Volmer方程對不同溫度下的熒光猝滅數據進行分析,分別探討Res、Cla對MLP的熒光猝滅機制。熒光猝滅的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:F為加入酚類物質時MLP的熒光強度;F0為未加酚類物質時MLP的熒光強度;Kq為速率常數,動態猝滅時,各種猝滅劑對生物分子的最大碰撞猝滅常數Kq為2.0×1010L/(mol·s);τ0為無淬滅劑(Res、Cla)時生物大分子的平均熒光壽命,約為10-8s;Q為酚類物質濃度;Ksv為Stern-Volmer淬滅速率常數。

對于靜態猝滅,利用雙對數方程分析結合常數與結合位點數。靜態猝滅的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ka為結合常數;n為結合位點數。

利用Van’t Hoff方差對熱力學參數進行擬合,進一步判斷酚類物質與桑葉蛋白間的相互作用力的類型。熱力學參數的計算如公式(3)、公式(4)所示:

(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKa

(4)

式中:ΔH表示焓變,kJ/mol;ΔG表示吉布斯自由能變化,kJ/mol;ΔS表示熵變,J/K;T為絕對溫度;Ka為結合常數;R為氣體常數,8.314 J/(mol·K)。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將MLP溶液和桑葉酚類/蛋白復合溶液在-60 ℃中預冷凍6 h后進行冷凍干燥,得到固形復合物。按樣品與溴化鉀粉末質量比1∶40混合,壓片,分別在4 000～400 cm-1波數內進行紅外光譜掃描,分辨率為2 cm-1,掃描32次。

1.3.5 差示掃描量熱(differential scanning calorimetry, DSC)分析

取4 mg樣品于坩堝中密封,以密封的空坩堝作為空白對照,測試溫度為25～150 ℃,升溫速率為10 ℃/min,氮氣流速為30 mL/min。

1.3.6 桑葉酚類/蛋白復合物體外消化吸收特性

參考肖雅麗[14]報道的方法進行模擬體外消化實驗。稱取一定量MLP及酚類/蛋白復合物,配制為質量濃度10.0 mg/mL的溶液,用1.0 mol/L HCl調節溶液pH至1.5,溶液37 ℃水浴加熱5 min后,將胃蛋白酶與樣品溶液以1∶50的質量比混合,在37 ℃下消化2 h,分別在0、10、20、30、60、120 min時取消化樣品,并將樣品加熱10 min滅活。取胃蛋白酶酶解120 min 的樣品,用1.0 mol/L NaOH調節pH至7.0,將胰蛋白酶與樣品以1∶50的質量比混合,在37 ℃下消化2 h,分別在0、10、20、30、60、120 min時取樣,并將樣品加熱10 min滅酶。

茚三酮法測定水解度(degree of hydrolysis, DH):稱取一定量酪氨酸溶于水中,分別配制成梯度濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的溶液,并分別加入1.0 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)和1.5%(質量分數)的茚三酮溶液,沸水中反應20 min ,冷卻至室溫,570 nm處測定其吸光度,繪制標準曲線。MLP的氨基含量測試同上,根據標準曲線計算MLP中氨基含量。取4.0 mL模擬消化樣品,加入1.0 mL 10%(質量分數)三氯乙酸溶液,于3 000 r/min 下離心10 min,以除去大分子物質與雜質;取4.0 mL上清液,分別加入1.0 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)和1.5%(質量分數)的茚三酮溶液,于沸水中反應20 min,冷卻至室溫,570 nm處測定其吸光度,水解度的計算如公式(5)所示:

(5)

1.3.7 抗氧化能力分析

采用DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力實驗測定樣品的抗氧化能力。稱取3.94 mg DPPH溶于50 mL容量瓶內,加無水乙醇定容,避光充分溶解,配制成0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,4 ℃貯藏備用。分別取5 mL MLP溶液、20 μmol/L酚類溶液和含20 μmol/L酚類/蛋白復合物溶液與5 mL DPPH 乙醇溶液混合,避光反應0.5 h,利用紫外-可見分光光度計測定其在517 nm處的吸光值,DPPH自由基清除率的計算如公式(6)所示:

(6)

式中:A1為樣品吸光度;A0為空白對照組的吸光度。

稱取一定量ABTS溶于10 mL容量瓶內,配制成7.0 mmol/L的ABTS溶液。稱取一定量的過硫酸鉀溶于10 mL容量瓶內,配制成5.0 mmol/L的過硫酸鉀溶液。將兩者等體積混合后,避光室溫放置12 h。加蒸餾水稀釋,使其在734 nm處吸光度為(0.70±0.02)。將4 mL ABTS溶液與0.5 mL樣品混合,避光反應6 min,在734 nm處測其吸光度,以相應蒸餾水為對照。ABTS陽離子自由基清除率的計算如公式(7)所示:

(7)

式中:Ai為樣品與ABTS反應后的吸光度;A0為蒸餾水代替樣品與ABTS反應后的吸光度;Aj為蒸餾水代替ABTS與樣品反應后的吸光度。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 桑葉中兩種酚類化合物與蛋白相互作用的紫外-可見光光譜分析

紫外-可見光光譜法通過測定從基態到激發態的電子躍遷效應來研究酚類與蛋白分子間的相互作用[15]。桑葉中不同濃度的Res、Cla分別與蛋白作用的紫外-可見光光譜分析結果見圖1。

a-Res;b-Cla圖1 不同濃度的Res、Cla對MLP溶液紫外-可見光光譜吸收的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Res and Cla on the UV-Vis absorption spectrum of MLP

由圖1可知,MLP在205、255 nm處具有明顯的吸收峰。分別加入Res與Cla反應后,酚類/蛋白產物在205、255 nm處的吸收峰增大,且隨著酚類濃度的增加,峰值呈上升趨勢,同時吸收峰發生紅移,最大吸收峰均紅移約1 nm。吸收峰強度和位移的變化表明Res與Cla與MLP發生了相互作用而形成了新的復合物。這可能是由于Res及Cla與MLP中的疏水基團結合形成絡合物,改變了MLP的空間構造,掩蓋了MLP色氨酸和酪氨酸的芳香環疏水基團,降低了復合物的疏水性能[16]。Cla與MLP作用后在320 nm處出現吸收峰,并隨著Cla濃度的增加而吸收峰的強度增強,表明MLP與Cla之間存在相互作用[17]。

2.2 桑葉中兩種酚類化合物與蛋白相互作用的熒光光譜分析

MLP的氨基酸組成中存在酪氨酸和苯丙氨酸,因含有苯環結構,在一定的激發波長下能夠產生熒光[18]。在不同溫度下,不同濃度的Res與Cla分別與MLP相互作用的熒光光譜見圖2。

a-Res,300 K;b-Cla,300 K;c-Res,305 K;d-Cla,305 K;e-Res,310 K;f-Cla,310 K圖2 Res、Cla分別與MLP在不同溫度下相互作用的熒光光譜分析Fig.2 Fluorescence spectra of interaction between Res and Cla and MLP at different temperatures

由圖2可知,酚類/蛋白體系溶液的最大發射波長約為340 nm,在300、305、310 K 3種作用溫度下,Res和Cla的加入均可降低MLP的熒光強度,且隨著Res和Cla濃度的增加,MLP發射峰的熒光強度呈現降低的趨勢,發射峰出現不同程度的藍移或紅移。此外,隨著溫度的升高,酚類對MLP熒光猝滅效果呈現降低的趨勢。例如,在Res和Cla濃度為20 μmol/L時,溶液的熒光猝滅強度與MLP相比,在3種溫度下分別下降了293.119 6、300.772 9、113.014 3 a.u.和354.085 4、112.983 9、105.225 0 a.u.。這可能是由于MLP中酪氨酸和苯丙氨酸殘基與Res和Cla的芳香環發生相互作用[19],導致氨基酸殘基所處的微環境發生變化,使蛋白內源熒光發生猝滅,并形成弱熒光的酚類/蛋白復合物。

利用Stern-Volmer方程分別分析了Res、Cla與MLP相互作用的猝滅機理、結合位點和結合常數,結果見表1和表2。

表1 酚類與MLP相互作用的熒光猝滅常數與線性相關系數Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of phenolics and MLP

表2 酚類與MLP相互作用的結合位點、表觀結合常數及線性相關系數Table 2 Apparent binding constants, binding sites numbers and correlation coefficients of phenolics and MLP

由表1可知,在酚類化合物作用濃度范圍內的曲線擬合具有較好的線性關系。在300、305、310 K的處理溫度下,Res和Cla的淬滅速率常數Ksv均隨著溫度的升高而逐漸減小。Res、Cla與MLP在上述3種溫度下的Kq分別為3.165×1012、2.922×1012、0.949×1012L/(mol·s)和3.728×1012、1.828×1012、0.805×1012L/(mol·s),均大于動態猝滅的最大碰撞速率常數2.0×1010L/(mol·s),與動態猝滅的特性相反[20]。因此可以推斷,Res、Cla對MLP的熒光猝滅可能均是由酚類化合物和蛋白相互作用引起的靜態猝滅,而不是由分子擴散和碰撞引起的動態猝滅[21],即熒光團與猝滅劑形成了非熒光的復合物[22]。

由表2可知,酚類與MLP的結合常數均在104L/mol 左右,表明二者之間能形成穩定的復合物[23]。隨著溫度的升高,2種酚類化合物與MLP結合常數均呈現降低的趨勢,表明Res、Cla與蛋白質均是通過氫鍵結合的放熱反應[24]。在相同的溫度下,Res與MLP的結合常數Ka值大于Cla與MLP的結合常數,說明Res與MLP的結合能力更強。在300 K的溫度下,2種酚類與MLP的結合位點數n值為1左右,表明MLP上存在單個結合位點,并且酚類與蛋白約以1∶1的摩爾比結合。從300 K升至310 K,2種酚類與MLP的結合位點下降,表明溫度對酚類與MLP結合形成的復合物的穩定性有影響,復合物隨著溫度的升高而變得不穩定[25],可能是升溫破壞了酚類與MLP之間的非共價相互作用。

進一步對酚類化合物與MLP之間相互作用的熱力學參數和作用力進行分析,ΔH、ΔS、ΔG的擬合結果見表3。

表3 酚類與MLP相互作用的熱力學參數Table 3 Thermodynamic constants of interaction between phenolics and MLP

非共價相互作用的作用力有氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、靜電相互作用力等。研究表明,當ΔH>0且ΔS>0時主要作用力為疏水作用力;當ΔH<0且ΔS>0時主要作用力為靜電力;當ΔH<0且ΔS<0時主要作用力為氫鍵和范德華力[26]。由表3可知,不同溫度下Res、Cla與MLP反應的ΔG均小于0,表明兩者之間的反應均是自發進行的,Res、Cla與MLP的結合過程均為放熱反應,升高溫度不利于兩者之間的結合。Res、Cla與MLP相互作用的ΔH和ΔS均小于0,表明氫鍵和范德華力在兩者結合中起主要作用。

2.3 桑葉中2種酚類化合物與蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析

a-Res與MLP相互作用;b-Cla與MLP相互作用圖3 Res、Cla與MLP作用的紅外光譜分析Fig.3 FT-IR spectrum analysis of the interaction between Res, Cla and MLP

2.4 DSC分析

通過差示掃描量熱法可以分析酚類與MLP結合后對蛋白質熱穩定性的影響,結果見圖4。

圖4 酚類與MLP形成的復合物的熱穩定性分析Fig.4 Thermal stability analysis of phenolics and MLP complexes

由圖4可知,MLP在50.14 ℃時出現吸熱峰,對應其熱變性溫度,其變性焓為3.40 J/g。當Res、Cla與MLP相互作用后形成的復合物的熱變性溫度均大于MLP的熱變性溫度,表明Res、Cla的加入會提高MLP的熱穩定性。其中Res與MLP作用后形成的復合物的熱變性溫度提高了4.32 ℃,變性焓提高了10.91 J/g,而Cla與MLP結合后熱變性溫度提高了2.81 ℃,變性焓提高了9.97 J/g。這可能是Res、Cla與MLP發生了較強的相互作用致使蛋白質的結構發生改變,從而提高了蛋白質的熱變性溫度[28]。

2.5 體外消化吸收特性分析

MLP及酚類/MLP復合物的體外消化過程中水解度變化結果見圖5。MLP及復合物在胃、腸2個消化階段總體呈上升趨勢。在胃消化階段,MLP及酚類/MLP復合物在消化開始時迅速水解,10 min后水解速度減緩,并隨著消化時間的延長,水解度趨于平緩。水解度的大小依次為:MLP>MLP-Cla>MLP-Res。在胃消化階段,MLP水解度最高為25.43%。在腸消化階段,MLP及酚類/MLP復合物的水解度均明顯增加,在腸消化階段的水解度變化顯著高于胃消化階段,表明蛋白質的消化主要發生在小腸消化階段?？傮w來看,水解度大小依次為:MLP>MLP-Cla>MLP-Res。MLP的水解度在胃、腸2個消化階段都是最高的,水解度可達55.06%,而MLP-Res的消化率最低,水解度僅為44.38%。MLP與酚類相互作用形成復合物后水解度降低,推測可能由于MLP受酚類化合物的影響,空間結構發生改變[29],復合物的形成抑制了消化酶對蛋白質的水解。Res、Cla和MLP之間的相互作用會影響蛋白質的消化特性。

圖5 桑葉酚類/蛋白復合物在體外模擬胃腸道消化階段DH的變化Fig.5 Changes of DH of mulberry leaf polyphenol/protein complexes during simulated gastrointestinal digestion in vitro注:A～C代表同一時間下,MLP、MLP-Cla、MLP-Res消化率的差異顯著(P<0.05);d～j代表在胃消化階段,不同時間同一樣品消化率的差異顯著(P<0.05);h、i代表在腸消化階段,不同時間同一樣品消化率的差異顯著(P<0.05)

2.6 抗氧化能力分析

采用DPPH和ABTS方法比較了MLP、Res、Cla及其復合物的抗氧化能力,結果見圖6。

a-DPPH自由基;b-ABTS陽離子自由基圖6 桑葉酚類/蛋白復合物對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力Fig.6 DPPHand ABTS, scavenging capacity of mulberry leaf polyphenol/protein complexes注:不同字母代表不同樣品差異顯著(P<0.05)

由圖6可知,MLP本身對于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力較弱,而Res和Cla對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力較強。當酚類與蛋白形成復合物后表現出較強的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力,其對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力明顯強于MLP(P<0.05),但較酚類化合物本身均明顯降低(P<0.05)。這些結果表明酚類與桑葉蛋白形成復合物后使酚類化合物對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力受到一定的抑制,導致抗氧化能力降低。這可能是由于部分酚羥基與蛋白發生相互作用,可以向自由基提供氫和電子的位置被掩蓋,降低了其與自由基碰撞的幾率,導致酚類/桑葉蛋白復合物的抗氧化能力低于游離酚類化合物[30]。

3 結論

通過對桑葉中內源酚類物質Res、Cla分別與蛋白之間的相互作用及功能性質進行研究,表明2種桑葉內源酚類化合物與蛋白均表現出較強的相互作用力,且可以形成較穩定的復合物。Res、Cla對蛋白的熒光猝滅類型均是靜態猝滅,氫鍵和范德華力是主要作用力;Res、Cla與MLP之間相互作用導致蛋白質的二級結構發生變化,提高了MLP的熱穩定性,抑制了消化酶對MLP的水解,提高了MLP本身對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力。研究結果將為桑葉作為食物基質中可能存在的酚類與蛋白之間的相互作用及對其功能特性的影響提供依據。